Экспрессия МРНК генов химиочувствительности как предиктор ответа на неоадъювантную химиотерапию при немелкоклеточном раке легкого

Автор: Цыганов Матвей Михайлович, Дерюшева Ирина Валерьевна, Родионов Евгений Олегович, Ефтеев Леонид Александрович, Миллер Сергей Викторович, Ибрагимова Марина Константиновна, Перминова Елена Евгеньевна, Черемисина Ольга Владимировна, Фролова Ирина Георгиевна, Тузиков Сергей Александрович, Литвяков Николай Васильевич

Журнал: Сибирский онкологический журнал @siboncoj

Рубрика: Клинические исследования

Статья в выпуске: 1 т.18, 2019 года.

Бесплатный доступ

Частота объективного ответа на неоадъювантную химиотерапию (НХТ) при лечении больных немел-коклеточным раком легкого (НМРЛ) в среднем составляет 16 %. В этой связи актуальным является поиск новых предсказательных факторов и маркеров, которые позволили бы с высокой вероятностью не только прогнозировать эффект НХТ, но и адекватно выбирать схему лечения для конкретного пациента. Цель исследования - изучение связи уровня экспрессии генов химиочувствительности с эффективностью неоадъювантной химиотерапии у больных немелкоклеточным раком легкого. мате-риал и методы. В исследование были включены 30 больных НМРЛ IIA-IIIB стадии. Из биопсийного материала нормальной и опухолевой тканей легкого до НХТ выделяли РНК. Уровень экспрессии генов химиочувствительности BRCA1, RRM1, ERCC1, TOP1, TOP2a, TUBB3, TYMS, GSTP1 оценивали при помощи обратно-транскриптазной количественной ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR). Ре-зультаты. Анализ показателей экспрессии изучаемых генов позволил установить значимые различия в группах больных с разным эффектом НХТ. В 67 % случаев (10/15) отсутствие экспрессии ERCC1 обусловливает наличие объективного ответа на лечение, по сравнению с группой, где присутствует экспрессия (p function show_abstract() { $('#abstract1').hide(); $('#abstract2').show(); $('#abstract_expand').hide(); }

Еще

Немелкоклеточный рак легкого, неоадъювантная химиотерапия, эффективность химиотерапии, гены химиочувствительности, экспрессия генов

Короткий адрес: https://sciup.org/140254236

IDR: 140254236   |   DOI: 10.21294/1814-4861-2019-18-1-13-20

Текст научной статьи Экспрессия МРНК генов химиочувствительности как предиктор ответа на неоадъювантную химиотерапию при немелкоклеточном раке легкого

В настоящее время установлено, что эффек‑ тивность применяемой НХТ у больных немелко‑ клеточным раком легкого сильно варьирует [1–3]. В исследовании K. Pisters et al. [4] сообщается о 12 % больных, у которых достигнут полный ответ (9 из 73), J.A. Roth et al. [5] показали отсутствие эффективности НХТ у 28 пациентов, R. Rosell et al. [6] наблюдали положительный ответ на лечение у 3 % (1 из 30) больных НМРЛ. Показатель полного патологического ответа, описанный в данных ис‑ следованиях, составляет 4 % (диапазон – 0–16 %). Таким образом, частота объективного ответа на неоадъювантную химиотерапию при лечении паци‑ ентов с НМРЛ остается сравнительно невысокой.

Исходя их этого, основным трендом в современ‑ ной онкологии является понимание молекулярно‑ биологических изменений в опухоли, поиск их ассоциаций с эффективностью лечения и про‑ гнозом заболевания. Исследование экспрессии молекулярно‑биологических маркеров может позволить выявить не только новые диагностиче‑ ские и прогностические факторы эффективности лечения, но и более персонализированно подойти к назначению рациональных режимов комбини‑ рованной химиотерапии и таргетных препаратов [7, 8]. Особое внимание многих исследователей привлекает возможность оценки чувствительности опухоли к определенным химиопрепаратам. При немелкоклеточном раке легкого ключевыми генами химиочувствительности являются BRCA1, RRM1, ERCC1 и др., которые определяют чувствитель‑ ность опухолевых клеток к отдельным химиопре‑ паратам. В этой связи актуальным и перспективным является поиск новых предсказательных факторов, основанных на экспрессии генов химиочувстви‑ тельности, поскольку их уровень патофизиологи‑ чески связан с ответом на тот или иной препарат посредством участия в метаболизме лекарств в клетках опухоли, трансмембранном транспорте, взаимодействии с мишенью, а также в механизмах реализации апоптоза и репарации [9].

Цель исследования – изучение связи уровня экспрессии генов химиочувствительности с эф‑ фективностью неоадъювантной химиотерапии у больных немелкоклеточным раком легкого.

Материал и методы

В исследование включены 30 больных НМРЛ IIA–IIIB (Т1–4N0–3M0) стадии с морфологически верифицированным диагнозом (табл. 1), которые находились на лечении в клинике НИИ онкологии Томского НИМЦ. Выборка представлена паци‑ ентами мужского пола. Статус курения: положи‑ тельный для всех. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией 1964 г. [10] (исправленной в 1975 г. и 1983 г.) и с разреше‑ ния локального этического комитета института, все пациенты подписали информированное согласие на исследование.

Всем пациентам проведено 2 курса неоадъю‑ вантной химиотерапии по схеме винорелбин 25 мг/м 2 (1‑й и 8‑й дни)/карбоплатин AUC 6 (во 2‑й день) с интервалом 3 нед и последующей оценкой эффекта. Эффективность НХТ была оценена с помощью шкалы RECIST. Химиотерапия прово‑ дилась при удовлетворительном общем состоянии и лабораторных показателях пациентов без откло‑ нений от нормы.

В качестве исследуемого материала был ис‑ пользован биопсийный материал нормальной и опухолевой ткани (~10 мм 3 ) легкого, который помещали в раствор RNAlater (Ambion, USA). После 24‑часовой инкубации при +4 ºС образцы биоматериала сохраняли при температуре –80 ºС для дальнейшего выделения РНК.

РНК выделяли из 30 парных образцов нормаль‑ ной ткани легкого и опухоли, с помощью набора RNeasy Plus mini Kit (Qiagen, Germany) в соответ‑ ствии с инструкцией производителя. На спектро‑ фотометре NanoDrop‑2000 (Thermo Scientific, USA) оценивали концентрацию и чистоту выделения РНК. Концентрация РНК составила от 100 до 500 нг/мкл, А260/А280=1,85–2,05; А260/А230=1,80–2,08. Целостность РНК оценивалась при помощи капил‑ лярного электрофореза на приборе Tape Station (Agilent Technologies, USA). RIN составил 6,6–9,2. Для получения кДНК на матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции с помощью на‑ бора реагентов для синтеза первой цепи кДНК RevertAid™ RT (Thermo Fisher Scientific, USA) со случайными гексануклеотидами.

Уровень экспрессии генов: BRCA1, RRM1, ERCC1, TOP1, TOP2a, TUBB3, TYMS, GSTP1 оце‑ нивали при помощи обратно‑транскриптазной количественной ПЦР в режиме реального времени (RT‑qPCR) по технологии TaqMan на амплифика‑ торе Rotor‑Gene‑6000 (Corbett Research, Australia). ПЦР ставился в трех репликах в объеме 15 мкл, содержащем 250 мкM dNTPs (Sibenzyme, Рос‑ сия), 300 нM прямого и обратного праймеров, 200 нM зонда, 2,5 мM MgCl2, 19 SE buffer (67 мM Tris–HCl pH 8,8 при 25 ºC, 16.6 мM(NH4)2SO4, 0,01 % Tween‑20), 2,5 ед HotStart Taq polymerase (Sibenzyme, Россия) и 50 нг кДНК. Двухшаговая программа амплификации включала 1 цикл – 94 ºС, 10 мин – предварительная денатурация; 40 цикла – 1 шаг 94 ºС, 10 сек и 2 шаг 20 сек – при температуре 60 ºС. Уровень экспрессии генов: BRCA1, RRM1, ERCC1, TOP1, TOP2a, TUBB3, TYMS, GSTP1 оце‑ нивали при помощи обратно‑транскриптазной количественной ПЦР в режиме реального времени (RT‑qPCR) по технологии TaqMan на амплифика‑ таблица 1

характеристика клинического материала

Клинико‑морфологические параметры                        Количество больных (n=30)

Возраст ≤50 лет                           4 (13,3 %) >50 лет                          26 (86,7 %) Т1                              3 (10 %) Размер опухоли Т2                             5 (16,7 %) Т3                             17 (56,7 %) Т4                             5 (16,7 %) N0                            5 (16,7 %) Лимфогенное метастазирование N1                             15 (50,0 %) N2                            9 (30,0 %) N3                              1 (3,3 %) Клинико‑анатомическая форма рака легкого Центральный                      20 (66,7 %) Периферический                     10 (33,3 %) Гистологический тип Плоскоклеточный рак                  24 (80,0 %) Аденокарцинома                     6 (20,0 %) Полная регрессия                     0 (0,0 %) Эффект НХТ Частичная регрессия                    12 (40,0 %) Стабилизация                      18 (60,0 %) Прогрессирование                     0 (0,0 %) Объем операции Пневмонэктомия                     12 (40,0 %) Лобэктомия                       18 (60,0 %) торе Rotor‑Gene‑6000 (Corbett Research, Australia). Праймеры и зонды (FAM‑BHQ1) были подобраны с использованием программы Vector NTI Advance 11.5 и базы данных NCBI nih. gov/nuccore) (табл. 2). Синтез олигонуклеотидов и зондов осуществлялся в компании ДНК‑синтез (Россия). Остальные манипуляции и методика оценки относительной экспрессии генов описаны ранее [11].

В качестве результата оценивался уровень экспрессии исследуемых генов относительно гена‑рефери GAPDH и нормальной ткани легко‑ го. Экспрессия была оценена с помощью метода Pfaffl и формула (1) использовалась для того, чтобы определить отношение экспрессии между образцом и калибратором:

^^      }ACt,tar,get(caZibratDr—test)

Ratio ^^ ^ "^ Д Ct,re/( calibrator—test)     ,

где Е – эффективность реакции; Ct – пороговый цикл генов мишеней (target) и гена‑реферри (ref). ∆Ct, target(calibrator – test) = Ct гена мишени в калибраторе минус Ct гена мишени в опытном образце; ∆Ct, ref(calibrator – test) = Ct гена‑рефери в калибраторе минус Ct гена‑рефери в опытном образце [12]. Уровень экспрессии измерялся в условных единицах.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных программ «STATISTICA 8.0» (StatSoft Inc., USA). Для каж‑ дой выборки вычисляли среднее арифметическое и среднюю квадратичную ошибку. Деление по‑ казателей уровня экспрессии изучаемых генов осуществлялось по тертилям при помощи базовой статистики. Для проверки гипотезы о значимо‑ сти различий признака использовали критерий Вилкоксона – Манна – Уитни. Сравнение частот по качественным данным анализировали при по‑ мощи двухстороннего критерия Фишера .

Результаты и обсуждение

В результате проведенного исследования мы изучили связь начального уровня экспрессии ис‑ таблица 2

Последовательность праймеров и проб исследованных генов

Ген

Ампликон (bp)

Последовательность

GAPDH

F 5'‑gccagccgagccacatc‑3'

NM_002046.3

124 bp

R 5'‑ggcaacaatatccactttaccaga‑3'

Probe 5'‑cgcccaatacgaccaaatccg‑3'

RRM

F 5'‑actaagcaccctgactatgctatcc‑3'

NM_001033.3

94 bp

R 5'‑cttccatcacatcactgaacacttt‑3'

Probe 5'‑cagccaggatcgctgtctctaacttgca‑3'

ERCC1

F 5'‑ggcgacgtaattcccgacta‑3'

XM_005258638.1

121 bp

R 5'‑agttcttccccaggctctgc‑3'

Все транскрипты

Probe 5'‑accacaacctgcacccagactacatcca‑3'

BRCA1

F 5'‑acagctgtgtggtgcttctgtg‑3'

NM_007294.3

R 5'‑cattgtcctctgtccaggcatc‑3'

NM_007297.3

NM_007298.3

107 bp

NM_007299.3

Probe 5'‑catcattcacccttggcacaggtgt‑3'

NM_007300.3

TOP1

F 5'‑ggcgagtgaatctaaggataatgaa ‑3'

NM_003286.2

97 bp

R 5'‑ tggatatcttaaagggtacagcgaa ‑3'

Probe 5'‑accattttcccatcatcctttgttctgagc‑3'

TOP2A

F 5'‑agtcgctttcagggttcttgag‑3'

NM_001067.3

75 bp

R 5'‑tttcatttacaggctgcaatgg‑3'

Probe 5'‑cccttcacgaccgtcaccatgga‑3'

TUBB3

F 5'‑gggccaagttctgggaagtc‑3'

NM_006086.3

71 bp

R 5'‑cgagtcgcccacgtagttg‑3'

Probe 5'‑atgagcatggcatcgaccccagc‑3'

TYMS

F 5'‑tctggaagggtgttttgga‑3'

NM_001071.2

91 bp

R 5'‑tcccagattttcactccctt‑3'

Probe 5'‑tctttagcatttgtggatcccttga‑3'

GSTP1

F 5'‑ctggtggacatggtgaatgac‑3'

NM_000852.3

84 bp

R 5'‑cttgcccgcctcatagttg‑3'

Probe 5'‑aggacctccgctgcaaatacatctc‑3'

Примечания: все пробы – FAM →BHQ1; NM – номер последовательности РНК в NCBI Nucleotide Database ‑ core); bp – base pair; F – прямой праймер; R – обратный праймер; Probe – зонд.

Список литературы Экспрессия МРНК генов химиочувствительности как предиктор ответа на неоадъювантную химиотерапию при немелкоклеточном раке легкого

  • Felip E., Rosell R., Maestre J.A., Rodríguez-Paniagua J.M., Morán T., Astudillo J., Alonso G., Borro J.M., González-Larriba J.L., Torres A., Camps C., Guijarro R., Isla D., Aguiló R., Alberola V., Padilla J., Sánchez-Palencia A., Sánchez J.J., Hermosilla E., Massuti B.; Spanish Lung Cancer Group. Preoperative chemotherapy plus surgery versus surgery plus adjuvant chemotherapy versus surgery alone in early-stage non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2010 Jul 1; 28 (19): 3138-45. DOI: 10.1200/JCO.2009.27.6204
  • Pisters K.M., Vallieres E., Crowley J.J., Franklin W.A., Bunn Jr.P.A., Ginsberg R.J., Putnam Jr.J.B., Chansky K., Gandara D. Surgery with or without preoperative paclitaxel and carboplatin in early-stage non-smallcell lung cancer: Southwest Oncology Group Trial S9900, an intergroup, randomized, phase III trial. J Clin Oncol. 2010 Apr 10; 28 (11): 1843-9. DOI: 10.1200/JCO.2009.26.1685
  • Scagliotti G.V., Pastorino U., Vansteenkiste J.F., Spaggiari L., Facciolo F., Orlowski T.M., Maiorino L., Hetzel M., Leschinger M., Visseren-Grul C., Torri V. Randomized phase III study of surgery alone or surgery plus preoperative cisplatin and gemcitabine in stages IB to IIIA non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2012 Jan 10; 30 (2): 172-8. DOI: 10.1200/JCO.2010.33.7089
  • Pisters K., Kris M.G., Gralla R.J., Zaman M.B., Heelan R.T., Martini N. Pathologic complete response in advanced non-small-cell lung cancer following preoperative chemotherapy: implications for the design of future non-small-cell lung cancer combined modality trials. J Clin Oncol. 1993 Sep; 11 (9): 1757-62.
  • Roth J.A., Fossella F., Komaki R., Ryan M.B., Putnam J.B. Jr., Lee J.S., Dhingra H., De Caro L., Chasen M., Mc Gavran M. A randomized trial comparing perioperative chemotherapy and surgery with surgery alone in resectable stage IIIA non-small-cell lung cancer. J Natl Cancer Inst. 1994 May 4; 86 (9): 673-80.
Еще
Статья научная