Экспрессия про- и антиапоптозных генов в тканях почек крыс через 48 часов после монолатеральной ишемии-реперфузии почки

При проведении резекции почки по поводу сложной локализации опухоли с использованием длительной ТИП очень важно сохранить функцию не только оперируемой почки, но и минимизировать возможное повреждающее влияние ишемии\\ре-перфузии на функцию контрлатеральной почки. Целью данного исследования является расширение представлений о вызываемых моделированием односторонней ишемии/реперфузии молекулярных процессах в ткани обеих почек на основе изучения ассоциированных с апоптозом транскриптомных маркеров.

Материалы и методы. Для исследования использовали ткани левой и правой почек 42 белых лабораторных крыс-самцов. Животные были разделены на две группы, в обеих группах использовался золетиловый наркоз (30 мг\\кг, внутримышечно). Вошедшим в контрольную группу животным проводилась «ложная» операция (лапаротомия, ушивание брюшной полости). Включённым в опытную группу животным после лапаротомии с целью моделирования ишемии\\реперфузии на сосуды левой почки накладывали зажим на 20 мин. после чего кровоток в почке восстанавливали путем снятия зажима. Через 48 часов после операции животных забивали методом декапитации. Определение относительной экспрессии 12 генетических локусов (MDM2, BAX, BCL2, р53, AIFM1, APAF1, CASP8, CASP3, CASP9, CASP7, CIAP1, XIAP, ICAD) проводили методом RT-qPCR. RT-qPCR амплификация проводилась на термоциклере Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA). В качестве референтного гена использовали ACTB. Дизайн праймеров осуществлен с использованием референтных последовательностей ДНК NCBI GenBank. Тотальную РНК из тканей левой и правой почек выделяли методом гуанидин-тиоционат-фе-нол-хлороформной экстракции. После чего проводили обработку ДНК-азой 1.

Перед проведением реакции обратной транскрипции для проверки качества выделенной РНК проводили электрофорез в 2% геле агарозы, содержащем 1хTBE буфер, по методу, описанному Masek T. et al. (2005). Для синтеза кДНК использовали набор реагентов «РЕВЕРТА-L» («Интерлабсервис», Россия). Принцип метода заключается в анализе сигналов амплификации генов-мишеней и референтного гена в исследуемых пробах. Статистический анализ выполняли с использованием прикладных пакетов программ Microsoft Excel 2013 и STATISTICA 8.0. Оценку различий проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни для порогового уровня статистической значимости р<0.05.

Результаты. Через 48 часов после восстановления кровотока в левой почке крыс в результате проведенной ише-

XIX РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС

ОНКОУРОЛОГИЯ

мии/реперфузии, наблюдаются изменения транскрипционного профиля тканей как в левой, так и в правой почках относительно аналогичных показателей у контрольных животных. В левой почке крыс обнаружено достоверное (p<0,0005) увеличение экспрессии про-апоптозных генов CASP8 в 5,5 раз, CASP7 в 2,3 раза, CASP9 в 2,2 раза, р53 в 14,6 раза, BAX в 6,6 раза, APAF1 в 12,7 раза, AIFM1 в 3,1 раза и анти-апоптозных генов MDM2 в 2,9 раза, CIAP1 в 4,9 раза, XIAP в 9,0 раз и ICAD в 8,8 раза по сравнению с контрольной группой.

При этом в правой почке крыс (не была подвержена иши-мии/реперфузии) также обнаружено увеличение экспрессии про-апоптозных генов CASP8 в 10,3 раза, CASP7 в 3,3 раза, CASP9 в 2,7 раза, р53 в 18,9 раз, BAX в 6,4 раза, APAF1 в 9,3 раза, AIFM1 в 2,1 раза и анти-апоптозных генов MDM2 в 2,4 раза, CIAP1 в 2,2 раза, XIAP в 6,3 раза и ICAD в 6,4 раза по сравнению с контрольной группой.

Наблюдается активация генов как внешнего, так и митохондриального апоптозного пути, которая затрагивает ткани обеих почек. Причем в правой почке экспрессия про-а-поптозных генов р53 и CASP8 превышает аналогичные показатели в левой почке на 30% и 87% соответственно, в то время как экспрессия анти-апоптозных генов в левой почке выше. Наиболее сильно увеличивается экспрессия генов р53, BAX, CASP8 и APAF1. Из генов, связанных с ингибированием апоптоза, наиболее сильно увеличивалась экспрессия XIAP и ICAD.

Также, согласно полученным данным, в соотношении транскрипционной активности таких пар генов как р53/MDM2 и BAX/BCL2 наблюдается дисбаланс с учётом контрольных показателей: р53/MDM2(левая почка) =5, р53/MDM2(правая почка) =8 и BAX/BCL2(левая почка) =7, BAX/ BCL2(правая почка) =6. Это свидетельствует о ярко выраженной тенденции к многоуровневому преобладанию про-апоптозных процессов, как в левой (подвергавшейся непосредственному воздействию), так и в правой (интактной) почках крыс.

Заключение. В модельном эксперименте на крысах через 48 часов после монолатеральной ишемии-реперфузии левой почки обнаружена повышенная статистически достоверная транскрипция как про-апоптозных (CASP8, CASP7, CASP9, р53, BAX, APAF1, AIFM1), так и анти-апоп-тозных (MDM2, CIAP1, XIAP и ICAD) генов в тканях обеих почек. Это свидетельствует о вовлечении в патологический процесс контралатеральной почки при моделировании односторонней ишемии-реперфузии, что подтверждает тезис о системном воздействии на организм ишемии-реперфузии даже одной из почек, и о вероятности развития повреждения тканей в обеих почках. Важную роль в данном процессе играет баланс экспрессии про- и анти-апоп-тозных генов.