Экспрессия рецепторов цитокинов с общей y-цепью как маркеров функциональных фенотипов PD-1- и TIM-3-позитивных Т-клеток при множественной миеломе

Множественная миелома (ММ), второе по распространенности опухолевое заболевание системы крови, остается неизлечимым состоянием, несмотря на разработку и внедрение в практику ингибиторов протеасом и иммуномодулирующих препаратов (леналидомид, помалидомид), а также высокодозной химиотерапии с трансплантацией аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ауто-ТГСК) [1, 2].

Ранее было показано, что при ММ, как и при большинстве других опухолей, повышено содержание Т-клеток, экспрессирующих ингибиторные сигнальные («чек-поинт») рецепторы PD-1, TIM-3 и др. [3–6]. Транзиторная экспрессия чек-поинт рецепторов ассоциирована с активацией Т-клеток, а устойчивая – с Т-клеточным истощением, состоянием дисфункции Т-клеток памяти, возникающим при длительной антигенной стимуляции [7]. Контакт экспрессированных на опухолевых и стромальных клетках и растворимых чек-поинт лигандов (PD-L1/PD-L2 для PD-1, галектин-9 для TIM-3 и т.д.) с «истощенными» Т-клетками приводит к значительному ослаблению функциональной активности последних. Состояние Т-клеточного истощения обратимо на ранних этапах, блокада чек-поинт молекул моноклональными антителами предотвращает ускользание опухоли из-под иммунного надзора [7, 8].

Попытки использования моноклональных антител (ингибиторов чек-поинт рецептора PD-1), эффективных при ряде солидных опухолей и лимфоме Ходжкина, при ММ сопровождались снижением показателей выживаемости вследствие частого развития нежелательных явлений и низкой частоты объективного ответа на терапию [9, 10]. Неудовлетворительный ответ на таргетную анти-PD-1 терапию при ММ и большинстве неходжкинских лимфом может быть связан не с восстановлением функции истощенных Т-клеток, а с нарушением регулирования активированных Т-клеток, например, вирус-специфических или аутореактивных популяций, а также регуляторных Т-клеток (Трег). Ранее была показана возможность экспрессии PD-1 и TIM-3 эффекторными Т-клетками при стимуляции цитокинами с общей γ-цепью (IL-2, IL-7, IL-15, IL-21) in vitro и в процессе гомеостатической пролиферации in vivo [11–13], блокада ингибиторами чек-поинт молекул также может приводить к нарушению регуляции пролиферирующих Т-клеток с последующим развитием аутоиммунных нежелательных реакций. Также могут отличаться свойства Т-клеток, экспрессирующих разные ингибиторные сигнальные молекулы; по-видимому, TIM-3+ и особенно PD-1+TIM-3+Т-клетки относятся к более «истощенным» по сравнению с PD-1+, в значительной мере сохраняющим цитотоксический и цитокин-продуцирующий потенциал [6]. Изучение дополнительных фенотипических маркеров функционального состояния Т-клеток, экспрессирующих чек-поинт рецепторы, вероятно, позволит прогнозировать развитие иммуноопосредованных побочных реакций таргетной иммунотерапии.

Целью исследования явилось изучение маркеров активации, рецепторов гомеостатических цитокинов и транскрипционных факторов, экспрессируемых PD-1- и TIM-3-позитивными Т-клетками.

Материал и методы

В исследование включено 29 больных ММ (таблица), находившихся на стационарном лечении в отделении гематологии с февраля 2021 г. по апрель 2022 г. Данным пациентам ранее не проводили высокодозную химиотерапию с ауто-ТГСК. В качестве группы сравнения было обследовано 17 здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту. Исследования проводились после получения от всех участников письменного информированного согласия и были одобрены решением локального этического комитета НИИФКИ. Набор образцов периферической крови (ПК) проводили перед очередным курсом химиотерапии при абсолютном содержании лейкоцитов более 1×109/л.

Лизис эритроцитов проводили раствором VersaLyse («Beckman Coulter», Франция) в соответствии с инструкцией. Методом проточной цитометрии оценивали относительное содержание субпопуляций Т-клеток, позитивных по одному из ингибиторных сигнальных рецепторов (PD-1 или TIM-3) – PD-1+TIM-3- и TIM-3+PD-1-, а также двойных позитивных PD-1+TIM-3+ клеток в пуле CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов, используя анти-CD3 (FITC, PerCP), анти-CD8 (FITC, PE-Cy7), анти-CD4 (FITC, PerCP), анти-PD-1 (APC), анти-TIM-3 (PE, PerCP/Cy 5.5, BV421) моноклональные антитела («BD Biosciences», “Biolegend”, США). В каждой из PD-1- и/или TIM-3-позитивных субпопуляций, а также в CD4+ и CD8+ Т-клетках, не экспрессирующих ингибиторные сигнальные рецепторы PD-1 и TIM-3 (PD-1-TIM-3-), оценивали относительное содержание клеток, экспрессирующих рецепторы гомеостатических цитокинов/поверхностных маркеров активации: CD25 (PE), CD122 (BV510), CD127 (Alexa Fluor 647). Также проведена оценка внутриклеточного содержания фосфорилированного преобразователя сигнала и активатора транскрипции 5 (STAT5, signal transducer and

Таблица/Table

Характеристика пациентов Patient characteristics

Показатель/Characteristics                                          Значение/Value

Возраст, годы; медиана (мин-макс)/Age, years; median (min-max)                        57 (37–64)

Пол, женщины/мужчины/Gender, female/male17/12

Стадия по Durie–Salmon/Durie–Salmon stage II11

III18

Вариант/Types

IgG18

IgA7

Бенс–Джонса/Bence Jones3

Нет данных/Not available1

Ответ на терапию на момент исследования/Disease status at the time of the study

Полная ремиссия, очень хороший частичный ответ/

Complete remission, very good partial response Частичный ответ/Partial remission14

Минимальный ответ, рецидивирующая/рефрактерная множественная миелома/

Minimal response, relapsed/refractory multiple myeloma

Количество режимов химиотерапии перед исследованием/

Chemotherapy regimens before the analysis

• 1    (бортезомиб-содержащие режимы)/

1 (bortezomib-based regimens)

• 2    (+ леналидомид-содержащие режимы или DCEP/EDAP/

• 2    (+ lenalidomide-containing regimens or DCEP/EDAP)

≥3 (+ леналидомид-содержащие режимы + DCEP/EDAP/

≥3 (+ lenalidomide-containing regimens + DCEP/EDAP)

activator of transcription 5), транскрипционных факторов EOMES и FOXP3 (анти-pSTAT5 (PE, BD Biosciences), анти-EOMES (PE, Invitrogen), анти-FOXP3 (PerCP-Cy 5.5, BD Biosciences) соответственно). Для изучения pSTAT5 106 монону-клеарных клеток (МНК) активировали в течение 15 мин с интерлейкином-2 (IL-2; «Ронколейкин®», «БИОТЕХ НПК», Россия; конечная концентрация 100 нг/мл суспензии клеток), после чего обрабатывали рекомендуемым фиксирующим раствором BD Fix Buffer I и пермеабилизировали ледяным раствором BD Perm Buffer III (содержит 87,68 % метанол) при -20 °С на льду в соответствии с инструкцией. Фиксацию и пермеабилизацию МНК для оценки внутриклеточной экспрессии EOMES и FOXP3 проводили после инкубации клеток с моноклональными антителами против поверхностных антигенов; использовали набор растворов для фиксации/пермеабилизации Transcription Factor Buffer Set («BD Biosciences»). В качестве контролей были использованы набор контрольных частиц BD™ CompBeads Anti-mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set, немеченые МНК, оценка флюоресценции всех маркеров, кроме одного (“fluorescence-minus-one”). Содержание погибших клеток оценивали по включению 7-AAD. Исследование проводили по общепринятой методике с использованием параметров прямого и бокового светорассеяния и флюоресценции на проточном цитометре FACS Canto II (BD Biosciences). Анализ проводили после накопления 5×104-105 событий в регионе CD8+ Т-клеток. Стратегия гейтирования представлена на рис. 1.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft). Для оценки значимости различий между независимыми группами использовали U-критерий Манна–Уитни. Для оценки значимости различий зависимых выборок использовали критерий Вил-коксона для парных выборок. Данные в тексте и таблицах представлены в виде медианы и интерквартильного диапазона, если не указано другого. Различия считали статистически значимыми при р<0,05 (двустороннем).

Результаты

Относительное содержание PD-1- и TIM-3-позитивных субпопуляций Т-клеток представлено на рис. 2. Количество CD4+PD-1+TIM-3+ и CD8+PD-1+TIM-3+Т-клеток ПК было выше у больных ММ в ремиссии по сравнению со здоровыми донорами. Содержание исследуемых популяций было выше у больных с прогрессирующим течением по сравнению как с донорами, так и с пациентами в состоянии ремиссии (кроме CD4+TIM-3+ и CD8+TIM-3+ Т-клеток).

Рис. 1. Стратегия гейтирования Т-клеток, экспрессирующих ингибиторные сигнальные молекулы PD-1 и TIM-3 и маркеры активации CD25, CD122 больного множественной миеломой.

Представлены данные репрезентативного пациента

Fig. 1. Gating strategy of T cells expressing inhibitory signal molecules PD-1 and TIM-3 and activation markers CD25, CD122 in multiple myeloma patient. Representative multiple myeloma patient data are presented

Рис. 2. Относительное содержание PD-1+ и TIM-3+ субпопуляций Т-клеток периферической крови здоровых доноров и больных множественной миеломой. Представлено относительное количество PD-1+TIM-3-, TIM-3+PD-1- и PD-1+TIM-3+ CD4+ (А) и CD8+ (В) Т-клеток в ПК здоровых доноров (n=17), больных ММ в состоянии ремиссии (n=22) и с прогрессирующим течением (n=7).

Значимость различий: * – pu<0,05, ** – pu<0,005 по U-критерию Манна–Уитни

Fig. 2. Relative counts of PD-1+ and TIM-3+ T cell subsets in peripheral blood of healthy donors and multiple myeloma patients. Relative counts of PD-1+TIM-3-, TIM-3+PD-1-, PD-1+TIM-3+ CD4+ (А) and CD8+ (В) Т cells in peripheral blood of healthy donors (n=17), MM patients in remission (n=22) and with progressive disease (n=7) are presented. P-values are assessed with Mann–Whitney U-test.

* – pu<0.05, ** – pu<0.005

Для оценки функционального потенциала проведено сравнительное исследование экспрессии рецепторов цитокинов/маркеров активации CD25, CD122, CD127 четырьмя популяциями T-клеток, различающихся по экспрессии ингибиторных рецепторов PD-1 и TIM-3 – PD-1-TIM-3-, PD-1+TIM-3-, TIM-3+PD-1-, PD-1+TIM-3+, в образцах ПК здоровых доноров, больных ММ в состоянии ремиссии и у пациентов с прогрессией болезни.

У здоровых доноров PD-1- и TIM-3-позитивные популяции CD4+ и CD8+ T-клеток отличались более высокой долей CD122+ клеток по сравнению с PD-1-TIM-3- клетками. Среди СD4+PD-1+TIM-3+ клеток было выше относительное количество CD25+ и CD122+ клеток по сравнению с PD-1+ и TIM-3+ популяциями (рис. 3А). Доля CD122+ клеток была выше среди TIM-3+ и PD-1+TIM-3+ СD8+ T-клеток по сравнению с PD-1-ТIM-3- и PD-1+ популяциями (рис. 3В).

Различия между Т-клетками, изолированно экспрессирующими PD-1 или TIM-3, были более выражены у больных ММ в ремиссии заболевания. Большее относительное количество TIM-3+ и PD-1+TIM-3+ СD4+и СD8+ T-клеток экспрессировали рецепторы цитокинов с общей γ-цепью CD25, CD122, CD127 по сравнению с PD-1-ТIM-3- и PD-1+ Т-клетками, при этом среди PD-1+ Т-клеток доля CD25+ и CD127+ клеток была значимо ниже по сравнению с PD-1-ТIM-3- клетками (рис. 3C-D).

У больных ММ с прогрессированием болезни не было различий по экспрессии рецепторов гомеостатических цитокинов между PD-1-ТIM-3-и PD-1+ CD4+ клетками. Доля CD25+ клеток была значимо выше в субпопуляциях TIM-3+ и PD-1+TIM-3+ СD4+ Т-клеток, а CD122+ клеток – в PD-1+TIM-3+ СD4+ Т-клетках по сравнению с PD-1+ СD4+ Т-клетками (рис. 3Е). В пуле CD8+TIM-3+ Т-клеток было выше содержание CD25+ клеток по сравнению с PD-1+ популяцией, и CD122+ клеток – по сравнению с PD-1-ТIM-3- клетками (рис. 3F).

По сравнению со здоровыми донорами у больных ММ в ремиссии повышено содержание CD25+ клеток в пуле CD4+TIM-3+ Т-клеток (pu=0,039). У больных с прогрессирующим течением была выше доля CD122+ клеток среди CD4+PD-1+ и CD4+PD-1-ТIM-3- Т-клеток по сравнению со здоровыми донорами (pu=0,012 и pu=0,0061 соответственно) и больными ММ в ремиссии (pu=0,032 и pu=0,013 соответственно). У больных ММ с прогрессированием заболевания повышено содержание CD122+ клеток в пуле CD8+PD-1+ Т-клеток по сравнению со здоровыми донорами и больными в ремиссии (pu=0,047 и pu=0,015 соответственно) и среди CD8+TIM-3+ Т-клеток по сравнению с больными в ремиссии (pu=0,049). У больных ММ в ремиссии и с прогрессирующим течением было значимо меньшее количество CD127+ CD8+PD-1+ клеток по сравнению с донорами (pu=0,0025 и pu=0,045 соответственно). Эффекты гомеостатических цитокинов, передаваемые через рецепторы с общей γ-цепью (CD25, CD122, CD127, CD132), реализуются посредством активации-фосфорилирования STAT5 [14]. Состояние Т-клеточного истощения и в ряде случаев активации ассоциировано с транскрипционным фактором EOMES [15–17]. Была проведена оценка внутриклеточного содержания фосфорилированного STAT5 (pSTAT5) и EOMES в PD-1-TIM-3-, PD-1+, TIM-3+, PD-1+TIM-3+Т-клетках. CD4+ и CD8+ Т-клетки доноров и больных ММ сохраняли способность продуцировать pSTAT5 независимо от экспрессии PD-1 и TIM-3 (рис. 4). Значимое снижение pSTAT5+ клеток отмечено только среди CD4+TIM-3+ субпопуляции по сравнению с PD-1-TIM-3-и PD-1+CD4+ Т-клетками (рис. 4С).

У здоровых доноров и у больных ММ большинство PD-1- и TIM-3-позитивных популяций CD4+ и CD8+ T-клеток отличалось более высокой долей EOMES+ клеток по сравнению с PD-1-TIM-3- популяцией (рис. 4). При этом CD4+ Т-клетки, не экспрессировавшие PD-1 и TIM-3, у доноров и больных в ремиссии содержали незначительное количество EOMES+ клеток (5,4 и 4,6 % по медианам, соответственно), в то время как среди CD8+PD-1-TIM-3- Т-клеток содержание EOMES+ популяции составляло 27,9 и 39,4 % для доноров и больных в ремиссии соответственно. Это может свидетель- ствовать о разных функциях данного транскрипционного фактора в CD4+ и CD8+ Т-клетках.

Относительное содержание EOMES+ CD8+TIM-3+ клеток у доноров было значимо ниже по сравнению с CD8+PD-1+TIM-3+ клетками (рис. 4В); количество EOMES+ CD8+TIM-3+ клеток у больных ММ независимо от течения болезни было значимо ниже по сравнению с CD8+PD-1+ и CD8+PD-1+TIM-3+ клетками (рис. 4D, F).

У больных ММ с прогрессирующим течением было значимо выше количество EOMES+ клеток в популяции CD4+ Т-лимфоцитов независимо от

Рис. 3. Доля клеток, экспрессирующих рецепторы цитокинов CD25, CD122, CD127, в PD-1- и TIM-3-позитивных и негативных субпопуляциях Т-клеток периферической крови здоровых доноров и больных множественной миеломой. Представлено относительное количество CD25+, CD122+, CD127+ клеток среди PD-1-и TIM-3-позитивных и негативных CD4+ и CD8+ Т-клеток в ПК здоровых доноров (n=17) (А, В), больных ММ в состоянии ремиссии (n=19) (С, D) и с прогрессирующим течением (n=7) (E, F).

Значимость различий p<0,05 по критерию Вилкоксона для парных выборок:

* – p<0.05 comparing with PD-1^-TIM-3^- cells; ^#– р<0.05 comparing with PD-1⁺TIM-3⁺ cells; ^&  – р<0.05 comparing with PD-1⁺TIM-3^- cells

экспреcсии PD-1 и TIM-3 по сравнению с донорами (pu<0,05 для всех исследованных субпопуляций).

Интересно, что все CD25+ Т-клетки здоровых доноров и больных ММ, являясь pSTAT5+, независимо от экспрессии исследованных чек-поинт рецепторов были EOMES-негативными (рис. 5). Ранее такой закономерности не описано. Не выявлено такой ассоциации для рецепторов цитокинов CD122 и CD127.

Регуляторные Т-клетки, обладающие супрессорной активностью, также могут экспрессировать чек-поинт рецепторы PD-1 и TIM-3. Относительное содержание циркулирующих CD4+CD25hiCD127-FOXP3+ Трег составило 1,5 % (1,3–1,9 %), 1,9 % (1,4-2,2 %), 3,5 % (1,3-5,9 %) у здоровых доноров, больных ММ в ремиссии и больных ММ с прогрессированием болезни соответственно.

Рис. 4. Доля клеток, внутриклеточно экспрессирующих pSTAT5 и EOMES, в PD-1- и TIM-3-позитивных и негативных субпопуляциях Т-клеток периферической крови здоровых доноров и больных множественной миеломой. Представлено относительное количество EOMES+ и pSTAT5+ клеток среди PD-1-и TIM-3-позитивных и негативных CD4+ и CD8+ Т-клеток в ПК здоровых доноров (n=10) (А, В) больных ММ в состоянии ремиссии (n=9) (С, D) и с прогрессирующим течением (n=6) (E, F). Значимость различий р<0,05 по критерию Вилкоксона для парных выборок:

* - по сравнению с PD-1 — TIM-3^- клетками; # - по сравнению с PD-1 + TIM-3 + клетками: &  - по сравнению с PD-1 + TIM-3^- клетками Fig. 4. Frequencies of cells with intracellular expression pSTAT5 и EOMES in PD-1- and TIM-3-positive and negative Т cell subsets in peripheral blood of healthy donors and multiple myeloma patients. Relative counts of EOMES⁺ and pSTAT5⁺ cells in PD-1- and TIM-3positive and negative CD4⁺ and CD8⁺ Т cells in peripheral blood of healthy donors (n=10) (A, B), MM patients in remission (n=9) (C, D) and with progressive disease (n=6) (E, F) are presented.

P-values are assessed with Wilcoxon matched pairs test: * – p<0.05 comparing with PD-1^-TIM-3^- cells; ^#– p<0.05 comparing with PD-1 + TIM-3 + cells; &  - p<0.05 comparing with PD-1 + TIM-3^-cells

П|-----1 I I Hill] I I II ПП| I to3 10*      10s

PD-1 APC-A

PD-1

Specimen CD3-PerCP-TIM3-510-14

Q

Ql-l

Q3-T

Q4-1

pSTATS PE-A pSTAT5

Рис. 5. CD25+ Т-клетки не экспрессируют транскрипционный фактор EOMES. CD25+ CD4+ Т-клетки не содержат EOMES+ клеток независимо от экспрессии чек-поинт рецепторов PD-1 и TIM-3 (А). Значительная часть СD122+ CD4+ Т-клеток EOMES-позитивна (А). CD25+ CD4+ Т-клетки являются pSTAT5+ независимо от экспрессии чек-поинт рецепторов PD-1 и TIM-3 (В).

Представлены данные репрезентативного пациента Fig. 5. CD25+ Т cells did not express transcription factor EOMES. CD25+ CD4+ Т cells were EOMES-negative irrespectively of checkpoint receptor PD-1 and TIM-3 expression (A). A substantial part of CD122+ CD4+ Т cells were EOMES-positive (A). CD25+ CD4+ Т cells were pSTAT5-positive irrespectively of checkpoint receptor PD-1 and TIM-3 expression (B). Representative multiple

myeloma patient data are presented

Рис. 6. Доля CD4⁺CD25^hiCD127^-FOXP3⁺ регуляторных Т-клеток в PD-1- и TIM-3-позитивных и негативных субпопуляциях Т-клеток периферической крови здоровых доноров и больных множественной миеломой. Представлены (А) стратегия гейтирования репрезентативного пациента и (В) относительное количество CD4⁺CD25^hiCD127^-FOXP3⁺ Трег среди CD4⁺PD-1^-TIM-3^-, CD4⁺PD-1⁺, CD4⁺TIM-3⁺ Т-клеток в ПК здоровых доноров (n=12), больных ММ в состоянии ремиссии (n=11) и с прогрессирующим течением (n=6). Значимость различий: * – p<0,05 по критерию Вилкоксона для парных выборок; ^# – p_u<0,05 по U-критерию Манна–Уитни Fig. 6. Frequencies of CD4⁺CD25^hiCD127^-FOXP3⁺ regulatory Т cells in PD-1- and TIM-3-positive and negative Т cell subsets in peripheral blood of healthy donors and multiple myeloma patients. Gating strategy (A) and relative counts of CD4⁺CD25^hiCD127^-FOXP3⁺ regulatory Т cells in CD4⁺PD-1^-TIM-3^-, CD4⁺PD-1⁺, CD4⁺TIM-3⁺ Т cells in peripheral blood of healthy donors (n=12), MM patients in remission (n=11) and with progressive disease (n=6) are presented. P-values are assessed with Wilcoxon matched pairs test (* – p<0.05) and with Mann–Whitney U-test (^#– p_u<0.05)

Содержание Трег среди CD4+PD-1+ Т-клеток было значимо выше у больных ММ в ремиссии по сравнению со здоровыми донорами. Относительное количество Трег в пуле CD4+TIM-3+ Т-клеток не отличалось от CD4+PD-1-TIM-3- популяции у здоровых доноров и больных ММ, а также между донорами и больными ММ (рис. 6).

Обсуждение

Клинические испытания анти-PD-1 моноклональных антител при рецидивирующей/рефрак-терной ММ были прерваны в связи с тяжелыми побочными реакциями и снижением показателей выживаемости [9, 10]. Неудовлетворительный ответ на таргетную иммунотерапию может быть следствием чрезмерной активации PD-1+ Т-клеток, пул которых включает в себя истощенные, активированные, пролиферирующие под влиянием цитокинов с общей ɣ-цепью эффекторные Т-клетки, а также Трег [13, 18]. В этой связи представляется важным поиск доступных маркеров функционального состояния Т-клеток с фенотипом активиро-ванных/истощенных. Настоящая работа посвящена сравнительной характеристике циркулирующих PD-1- и TIM-3-позитивных Т-клеток, экспрессирующих рецепторы цитокинов с общей ɣ-цепью, у здоровых лиц и у больных ММ. В представленном исследовании, как и в большинстве более ранних работ, показано увеличение Т-клеток, экспрессирующих чек-поинт рецепторы, при ММ; неблагоприятное течение заболевания ассоциировано с увеличением экспрессии чек-поинт молекул [3–6].

По сравнению с донорами и больными ММ в ремиссии у больных ММ с прогрессирующим течением увеличено содержание CD8+PD-1+ и CD8+TIM-3+ Т-клеток, экспрессирующих CD122, β-цепь рецептора IL-2 и IL-15. CD8+CD122+ Т-клетки человека, как правило, относят к активированным клеткам памяти и, реже, к CD8+ регуляторным Т-клеткам [19–22]. В мышиной модели CD8+PD-1+CD122+ продуцировали IL-10 и предотвращали отторжение аллотрансплантата [23, 24]. Значение экспрессии PD-1 и TIM-3 этой субпопуляцией у человека в норме и при патологии неизвестно и требует дальнейшего изучения.

Часть PD-1+ и TIM-3+Т-клеток экспрессировали CD25, высокоаффинную ɑ-цепь рецептора IL-2. Увеличение экспрессии CD25 контролируется pSTAT5 и наблюдается при активации Т-лимфоцитов через Т-клеточный рецептор и при гомеостатической пролиферации. Нами впервые показано, что CD25+ Т-клетки здоровых доноров и больных ММ не экспрессировали транскрипционный фактор EOMES, ассоциируемый с Т-клеточным истощением и терминальной активацией [15–17]. Для других рецепторов гомеостатических цитокинов такой связи выявлено не было. Таким образом, CD25 может заменить внутриклеточное определение EOMES для оценки функционального состояния Т-клеток. Вероятнее всего, коэкспрессия CD25 и чек-поинт рецепторов могут быть индикатором активированных (неистощенных) и/или пролиферирующих в условиях лимфопении Т-клеток, учитывая выявленную сохранную способность PD-1+ и TIM-3+ Т-клеток фосфорилировать STAT5 при кратковременной стимуляции IL-2, а также маркером активированных CD4+CD25+CD127-FOXP3+ естественных регуляторных Т-клеток.

В нашем исследовании относительно небольшая часть TIM-3+ и несколько бóльшая PD-1+ CD4+CD25+ Т-клеток больных ММ были идентифицированы как CD4+CD25hiCD127-FOXP3+ Трег. Увеличение PD-1- и/или TIM-3-экспрессирующих

Трег описано в моделях опухолей и при различных онкологических заболеваниях, в большинстве исследований отмечается выраженный супрессорный потенциал PD-1+/TIM-3+ Трег [25–28]. Клиническое значение этих Трег, равно как и последствия анти-PD-1 блокады, остаются предметом дискуссий.

Нужно отметить, что ценность определения EOMES как маркера истощения в пуле CD8+ Т-клеток, по-видимому, снижена, так как и у здоровых доноров, и у больных ММ значительная часть PD-1/TIM-3-негативных CD8+ Т-клеток, в отличие от CD4+ Т-клеток, была EOMES+. В литературе также есть указания на то, что для CD8+ Т-клеток экспрессия EOMES ассоциирована как с активацией [29, 30], так и с терминальным Т-клеточным истощением, характеризующимся выраженным снижением функциональной активности и отсутствием ответа на анти-PD-1 таргетную терапию [16, 31].

Т-клетки, экспрессирующие TIM-3 (TIM-3+PD-1- и PD-1+TIM-3+), отличались более высокой долей CD25+ и CD122+ клеток по сравнению с PD-1+ популяцией Т-клеток. Более высокое содержание рецепторов гомеостатических цитокинов в популяции TIM-3+ Т-клеток может говорить о преимущественном вовлечении этой ингибиторной молекулы в контроль гомеостатической пролиферации зрелых Т-клеток в условиях лимфопении, в то время как молекула PD-1 может быть более ассоциирована с регуляцией активации через Т-клеточной рецептор. Ранее нами были описаны различия в функциональной активности между PD-1+ и TIM-3+ (включая PD-1+TIM-3+) Т-клетками при ММ; значительная часть CD8+PD-1+ и CD4+PD-1+ Т-клеток обладала выраженным цитотоксическим и цитокин-продуцирующим потенциалом, не отличаясь от PD-1-негативного компартмента либо превосходя его, в то время как TIM-3+ и PD-1+TIM-3+ Т-клетки были более ассоциированы с состоянием Т-клеточного истощения [6].

Выявленные различия подчеркивают неоднородность пула Т-клеток, относимых к дисфункциональным и «истощенным», экспрессирующих разные чек-поинт рецепторы и их комбинации. Ограничением настоящего этапа исследований является небольшое число наблюдений пациентов с прогрессирующим течением заболевания. Тем не менее изучение экспрессии маркеров активации Т-клеток позволяет точнее определить степень Т-клеточной дисфункции при ММ и в перспективе может быть использовано для прогноза безопасности и эффективности таргетной иммунотерапии.

Заключение

Пул T-лимфоцитов, экспрессирующих ингибиторные чек-поинт рецепторы PD-1 и/или TIM-3, у больных ММ включает в себя: CD25+EOMES-активированные клетки (содержание выше в популяции TIM-3+ Т-клеток по сравнению с PD-1+),

CD4+CD25+CD127-FOXP3+регуляторные Т-клетки (PD-1>TIM-3), по-видимому, CD8+CD122+ регуляторные Т-клетки, CD4+CD25-EOMES+ дисфункциональные клетки. Оценка поверхностной экспрессии CD25 может заменить определение внутриклеточного содержания транскрипционного фактора EOMES. EOMES в бóльшей степени маркер истощения для CD4+ Т-клеток, но не для CD8+ Т-клеток, в которых он более ассоциирован с активацией. Доля CD4+ Трег среди циркулирующих PD-1+ и TIM-3+Т-клеток невысока. Функциональные свойства PD-1+ и TIM-3+ CD8+CD122+ Т-клеток требуют дальнейшего изучения. Более