Экспрессия рекомбинантных генов, кодирующих фрагменты протективно значимых белков вируса африканской чумы свиней, в эукариотических клетках

Африканская чума свиней (АЧС) — вирусная контагиозная септическая болезнь свиней, характеризующаяся лихорадкой, признаками токсикоза, геморрагическим диатезом и высокой летальностью, может протекать сверхостро, остро, подостро, хронически и бессимптомно. При острой, наиболее распространенной форме инфекции, до 100 % животных погибают в течение 5-10 сут после начала проявления клинических признаков. Болезнь поражает диких кабанов и домашних свиней, передается от больных животных и вирусоносителей контактно, алиментарно, а также транс-плацентарно (1). В юго-восточной Африке эволюция вируса АЧС происходит в процессе сильватического цикла, в который включены бородавочники и клещи рода Ornitodoros (2, 3). После регистрации в 2007 году вспышек АЧС в Грузии болезнь распространилась в Армению, Азербайджан, Нагорный Карабах, Иран, Абхазию, Россию, страны Прибалтики, Белоруссию, Польшу, на Украину (4-6).

Контроль за инфекцией осложняется отсутствием средств специфической профилактики. Попытки вакцинации домашних свиней аттенуированными штаммами вируса АЧС в Испании и Португалии в 1960-х годах закончились неудачно (7, 8). Позднее подтвердилось, что из-за высо-

Работа выполнена в рамках проекта Российского научного фонда «Создание кандидатной вакцины портив африканской чумы свиней на основе химерных вирусов» ¹ 16-16-00090.

кой вероятности реверсии и неудовлетворительных иммунобиологических характеристик многих аттенуированных штаммов живые вакцины на их основе непригодны для широкого применения (9).

Эксперименты по созданию инактивированных или субъединичных вакцин против АЧС по общепринятым технологиям также оказались неудачными ввиду их неспособности индуцировать клеточный иммунитет, который играет решающую роль в формировании защиты при АЧС (1012). Тем не менее, исследования по разработке безопасных кандидатных защитных препаратов для временной защиты свиней, обеспечивающих их защиту в энзоотичных зонах или плановый убой на крупных свинокомплексах, продолжаются (9, 13). Показано, что иммунизация свиней рекомбинантными белками р30 и р54 или препаратом серотипоспецифического вирусного мажорного гликопротеина ГП 110-140 приводила к частичной защите животных от контрольного заражения гомологичными вирулентными изолятами (14-17).

Результаты изучения протективных свойств ДНК-конструкций, содержащих гены белков р30, р54 и CD2v (ГП 110-140), свидетельствуют о критически важной роли последнего в формировании защиты от АЧС (18, 19). Таким образом, исследование антигенных и иммуногенных характеристик продуктов экспрессии ДНК-конструкций, кодирующих гены протек-тивно значимых белков вируса АЧС, открывает перспективы создания препаратов нового поколения против вирулентных изолятов различных сероиммунотипов. Необходимые этапы этих работ — клонирование генов в составе ДНК-конструкций, экспрессия в эукариотических системах и подтверждение получения антигенно активных продуктов трансляции (20). Полагаем, что в качестве источников вирусных генов следует использовать аттенуированные штаммы вируса АЧС, охарактеризованные по сероимму-нотипу и протективным свойствам.

В представляемой работе впервые созданы гибридные плазмиды, пригодные для протеомных исследований и разработки ДНК-вакцины против вируса АЧС III сероиммунотипа.

Наша цель заключалась в получении ДНК-конструкций, содержащих фрагменты генов CP204L , E183L , EP402R вируса АЧС III сероимму-нотипа, и идентификации в трансфицированных ими эукариотических клетках соответствующих антигенно активных продуктов трансляции рекомбинантных белков rp30, rp54, rCD2v.

Методика. Штаммы вируса АЧС III и VIII сероиммунотипов Мозамбик-78 (М-78) и Ставрополь 01/08 (высоковирулентные), а также штамм МК-200 и вариант Ставрополь 01/08 А₄С₂/9к (аттенуированные) депонированы в Государственной коллекции микроорганизмов (Всероссийский НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии — ВНИИВВиМ) (21-23).

Схемы получения антисывороток были следующими: ¹ 1 — 2-кратное внутримышечное введение домашней свинье аттенуированного варианта Ставрополь 01/08 А4С2/9к в дозе 103,0 ГАЕ50 (0-е и 14-е сут), внутримышечное заражение вирулентным штаммом Ставрополь 01/08 в дозе 103 ГАЕ50 (на 28-е сут) и обескровливание животного (35-е сут после начала эксперимента); ¹ 2 — отбор крови на 24-е сут после 1-кратной внутримышечной инокуляции дикому кабану аттенуированного штамма МК-200 (106,5 ГАЕ50); ¹ 3 — 1-кратное внутримышечное введение домашней свинье аттенуированного штамма МК-200 в дозе 106,5 ГАЕ50 (0-е сут), внутримышечное заражение вирулентным штаммом М-78 в дозе 103 ГАЕ50 (на 21-е сут) и обескровливание животного (на 35-е сут после начала эксперимента).

При ПЦР в состав реакционной смеси входили праймеры, фланки- рующие гены CP204L, E183L, EP402R вируса АЧС штамма МК-200. Для накопления ПЦР-продуктов использовали полученные ранее рекомбинантные плазмиды pJET1.2/p30-M200/2, pJET1.2/p54-M200/1 и pJET1.2/CD2v-M200/10. Лигирование осуществляли с применением коммерческого набора CloneJET PCR Cloning Kit согласно рекомендациям фирмы-изготовителя («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США) и описанию (24).

Компетентные клетки штамма Escherichia сoli XL-1 трансформировали методом теплового шока в присутствии ионов Ca²⁺ (25). Из отобранных устойчивых к ампициллину трансформантов выделяли плазмиды, наличие специфических вставок подтверждали рестрикционным анализом.

Нуклеотидные последовательности полученных химерных структур, содержащих гены CP204L , E183L и EP402R в составе плазмид pJET1.2 и pCI-neo, определяли на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3130xl («Applied Biosystems, Inc.», США).

Линию человеческих эмбриональных клеток почки, трансформированных геном Т-антигена вируса SV40 (HEK293T; Коллекция культур клеток ВНИИВВиМ), трансфицировали рекомбинантными плазмидами pCI-neo/ASFV/p30/1, pCI-neo/ASFV/p54/1 и pCI-neo/ASFV/CD2v/1 кальций-фосфатным методом согласно рекомендациям (26) и культивировали после смены среды Игла МЕМ (ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова», Россия) от 1 до 5 сут. Трансфекцию контролировали по экспрессии GFP белка (положительный контроль — плазмида phMGFP) («Promega», США) на инвертированном флуоресцентном микроскопе Olympus MIT-2 («Olympus Corp.», Япония). Трансфицированные клетки снимали с субстрата механически, предварительно отмыв 3-кратно от сывороточных белков фосфатно-буферным раствором с рН 7,2 (ФБР), осаждали центрифугированием (3000 g, 10 мин) и замораживали при - 70 ° С. Далее 10 6 клеток лизировали в 1 см³ RIPA-буфера (24), клеточный дебрис осаждали центрифугированием (3000 g, 20 мин) и исследовали супернатанты методом иммунблоттинга. Электрофорез, электроперенос и иммуноблоттинг осуществили по методам U.K. Laemmle (27), J. Kyhse-Andersen (28) и J.M. Escribano, E. Tabares (29).

Для сравнения нуклеотидных последовательностей созданных химерных конструкций c опубликованными в GenBank применяли программу BLASTn (доступна на сайте . Выравнивание и анализ проводили с помощью программ BioEdit 7.2.5 (intellectual property of Tom Hall, Freeware) и uGene 1.22 (ООО «Новосибирский центр информационных технологий УниПро»). Прогнозирование эпитопов и структурных элементов выполняли с использованием онлайн-серверов (Technical University of Denmark, .

Результаты. Би-оинформатический ана-

Специфичные олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие участки генов белков p30, p54 и CD2v лиз трех потенциально протективных белков вируса АЧС (p30, p54 и CD2v) штамма MK-200 выявил сигнальные последовательности, транс-

Наименование       Нуклеотидная последовательность

F-p30Domen 5´-AGTACTGTTAAGTATGATATTGTGAAATCTG-3´

R-p30Domen 5´-AAGTTTAATAACCATGAGTCTTACCACC-3´

F-p54Domen 5´-TCCTCAAGAAAGAAAAAAGCTGCTGCTATTGAG-3´

R-p54Domen 5´-CAAGGAGTTTTCTAGGTCTTTATGCGTATAGG-3´

F-CD2-IgHA 5´-AGTTATAATGAAACAATAATTTTAAATAGTAAT-3´

R-CD2-IgHA 5´-GTGATTTCCTAATAAAAAAGAATATTGATAATA-3´ мембранные регионы и возможные сайты посттрансляционных модифи- каций. В результате были определены внеклеточные (вневирионные) домены трансмембранных белков, которые несут в аминокислотных последовательностях наибольшее число прогнозируемых B- и Т-клеточных эпитопов.

Клонируемый регион гена EP402R 49-651 п.н. (201 а.о.) исключал нативные сигнальные и трансмембранные регионы, а также цитоплазматический домен 721-1137 п.н. Аналогичные регионы локализованы для генов CP204L (142-546 п.н.) и E183L (160-597 п.н.). Дизайн праймеров осуществляли в соответствии с дальнейшей стратегией «бесшовного» клонирования ДНК-конструкций по D.G. Gibson с соавт. (30). Нуклеотидные последовательности рассчитанных праймеров приведены в таблице.

Для повышения эффективности внутриклеточного сортинга указанных белков использовали универсальные сигнальные элементы из гетерологичных вирусов (сигнальная последовательность белка слияния F парагриппа человека 1 и трансмембранный регион белка HN вируса Сендай). Для этого ампликоны p30-Domain, p54-Domain и CD2v-IgHA были суб-клонированы с сигнальными последовательностями и трансмембранными регионами в плазмидный вектор pJET1.2 («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). На основании ПЦР-скрининга и рестрикционного анализа отобрали клоны, содержащие плазмиды со специфическими нуклеотидными вставками. Секвенирование плазмид показало целостность рамок считывания полученных химерных последовательностей.

На следующем этапе получали ДНК-конструкции, экспрессирующие в клетках эукариот. Для этого соответствующие нуклеотидные последовательности были переклонированы в плазмидный вектор pCI-neo («Promega», США) по сайтам рестрикции NheI и SmaI. Цитомегаловирусный промотор в векторе pCI-neo обеспечивает высокую экспрессию в эукариотических системах. Карты открытых рамок считывания химерных генов приведены на рисунке 1.

А

Sinai (1646)

SV40 ПА герминатор

Nhel (1085)

CMV энхансер/промотор™1* ИН1Р®Н I Химерная ОРС [рЗО] Т7 промотор

CMV промотор

Сигнал пептид |

рЗО Domain

Трансмембранный регион

pCI-neo/ASFV/p30

5991 п.н.

Б

Nhel 1085)

SmalDfiQl)

CMV энхансср/промотор™^1 И1г7°щ)0М010р Химерная ОРС [р54]

SV40 ПА терминатор

CMV промотор

Сигнал пептид |

р54 Domain

Трансмембранный регион

pCI-neo/ASFV/p54

6036 п.н.

В

Nhel (1085)                        Smal (1829)

• * •                                                                      ।           ।                                                          ।                                              I ।                           * • •

CMV энхансер/промо^^™1_{омо тор}^^ ^0PC l^CD2v' ^ 49 ПА терминатор

CMV промотор Сигнал пептид CD2v-IgHA Domain Трансмембранный регион pCI-neo/ASFV/CD2v 6174 н.п.

Рис. 1. Схема открытых рамок считывания для химерных генов с клонированными последовательностями фрагментов, кодирующих белки вируса африканской чумы свиней p30, p54 и СD2v, в полученных ДНК-конструкциях: А — pCI-neo/ASFV/p30, Б — pCI-neo/ASFV/p54, В — pCI-neo/ASFV/CD2v; CMV энхансер/промотор — энхансер раннего ответа промотора цитомегаловируса, CMV промотор — промотор цитомегаловируса, хим интрон — химерный интрон, T7 промотор — промотор фага T 7 , SV40 ПА терминатор — сигнал полиаденилирования и терминатор из ДНК вируса SV40, Сигнал пептид — сигнальная последовательность.

Анализ полученных рекомбинантных плазмид pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 и pCI-neo/ASFV/CD2v методом ПЦР с диагностическими праймерами показал, что на этих матрицах синтезируются ампли- коны, размеры которых соответствуют расчетным (рис. 2). Для дальнейшей работы выбрали первые клоны каждой конструкции.

Для экспрессии полученных рекомбинантных генов in vitro использовали перевиваемую культуру HEK293T (клетки почки эмбриона человека, трансформированные геном Т-антигена вируса SV40). Наличие ориджи-на репликации вируса SV40 в составе pCI-neo обеспечивает эписомальную репликацию плазмид. После трансфекции монослоя клеток HEK293T кальций-фосфатным методом (конфлюентность 80-90 %) каждой из рекомбинантных плазмид и последующего культивирования в течение 1-5 сут рассчитывали эффективность трансфекции как долю числа флуоресцирующих клеток от общего наблюдаемого при люминесцентной микроскопии. В качестве контроля аналогичные эксперименты в идентичных условиях проводили с плазмидой phMGFP.

Рис. 2. Электрофореграмма разделения ПЦР-продуктов химерных генов в 1,5 % агарозном геле при скрининге рекомбинантных плазмид: 1, 2, 3 — ампликоны p30 (в качестве матрицы использованы выделенные из Escherichia сoli плазмиды pCI-neo/ASFV/p30); 4, 5, 6 — ампликоны p54 (в качестве матрицы использованы выделенные из E . сoli плазмиды pCI-neo/ASFV/p54); 7, 8, 9 — ампликоны CD2v (в качестве матрицы использованы выделенные из E . сoli плазмиды pCI-neo/ASFV/CD2v); М — Lambda DNA/PstI Marker (маркер размера фрагментов ДНК 247-11501 п.н., «GeneOn GmbH», Германия).

Рис. 3. Иммуноблоттинг, демонстрирующий трансляцию рекомбинантных белков rp30 (А) , rp54 (Б) и rp CD2v (В) в трансфицированных плазмидами pCI-neo/ASFV/p30/1, pCI-neo/ASFV/p54, pCI-neo/ASFV/CD2v клетках HEK293T и антигенную активность rp30 (Г): 1-4 — номера антисывороток, 5-13 — разведения лизата клеток HEK293T (от 1:2 до 1:512 с 2-кратным шагом), экспрессирующих rp30. Слева стрелками указано местоположение и молекулярные массы вирусоспецифических полипептидов.

Полученные результаты, которые представлены на рисунке 3 (А, Г), отра- жают антигенную активность рекомбинантного (r)

белка rр30, синтезированного в клетках HEK293T, трансфицированных плазмидой pCI-neo/ASFV/p30/1. По данным иммуноблоттинга с антителами АЧС-позитивных антисывороток крови домашних свиней и дикого кабана (разведение 1:20), его молекулярная масса составляет 21,6 кДа. С сывороткой крови от интактной свиньи вирусоспецифических антигенов мы не выявили. Иммуноблоттинг белков лизата из нетрансфицированных клеток HEK293T со всеми антисыворотками дал отрицательные результаты (данные не приведены). Титрование лизата клеток HEK293T, трансфицированных плазмидой pCI-neo/ASFV/p30/1 (от 1:2 до 1:512 с 2-кратным шагом) (см. рис. 3, Г), выявило антигенную активность вплоть до разведения 1:128, что свидетельствует о высокой экспрессии rр30.

Методом иммуноблоттинга с использованием антисыворотки ¹ 3 в лизате трансфицированных pCI-neo/ASFV/p54 клеток HEK293T было показано присутствие мажорного полипептида с молекулярной массой 20,9 кДа и минорного — с массой 36,3 кДа (см. рис. 3, Б), а при трансфекции pCI-neo/ASFV/CD2v выявлялись мажорные полипептиды 39,8 и 63,1 кДа и минорные 28,8 и 104,7 кДа (см. рис. 3, В).

Расчетные молекулярные массы немодифицированных рекомбинантных белков составили 21,6 кДа (rр30), 18,7 кДа, (rр54) и 28,6 кДа (rCD2v). По результатам иммуноблоттинга, фактические молекулярные массы полученных нами рекомбинантных полипептидов соответствовали или были близки с расчетными: для rр30 — 21,6 кДа, для rр54 — 20,9 кДа и 36,3 кДа (вероятно, димер гр54). По данным P. G o mez-Puertas с соавт. (16) и F. Rodriguez с соавт. (31), масса мономера полноразмерного р54 — 2428 кДа. В трансфицированнных pCI-neo/ASFV/CD2v клетках HEK293T транслированные вирусоспецифические полипептиды имели молекулярные массы 28,8; 39,8; 63,1 и 104,7 кДа. Первый из них по размеру соответствовал расчетной немодифицированной молекуле rCD2v. Остальные, по-ви-димому, представляли собой формы, в разной степени модифицированные в процессе гликозилирования. Эти результаты соответствуют данным L.C. Go-atley и L.K. Dixon (32), которые в клетках Vero, трансфицированных плазмидой SV5CD2vHA, идентифицировали полипептиды рекомбинантного CD2v с молекулярными массами 26, 63, 89 и 104 кДа. Под действием ингибитора гликозилирования туникамицина или эндогликозидаз D и F авторы дополнительно выявляли полипептиды размером 42 и 47 кДа (32).

Таким образом, получены ДНК-конструкции с фрагментами генов вируса африканской чумы свиней (АЧС) CP204L , E183L , EP402R . Методом иммуноблоттинга с использованием АЧС-специфических антисывороток показана антигенная активность полипептидов, экспрессируемых в результате трансфекции культуры клеток HEK293T рекомбинантными плазмидами pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 и pCI-neo/ASFV/CD2v с нуклеотидными последовательностями для рекомбинантных белков (соответственно rp30, rp54 и rpCD2v). На следующем этапе предстоит определить иммуногенные свойства рекомбинантных плазмид и усовершенствовать полученные генные конструкции для создания соответствующих про-тективных форм.