Экспрессия тирозинкиназных рецепторов на субпопуляциях лимфоцитов периферической крови больных почечно-клеточным раком и здоровых добровольцев

Наиболее распространенным и изученным гистологическим вариантом рака почки является светлоклеточный почечно-клеточный рак (ПКР) [1], ассоциированный с высокой частотой мутаций гена VHL [2]. Инактивация VHL приводит к экспрессии факторов, индуцируемых гипоксией, (HIF) [3–5] и их мишеней, прежде всего, ростовых факторов и тирозинкиназных рецепторов (ТКР), включая рецепторы фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), рецепторы фактора роста фибробластов (FGFR), а также рецепторы фактора роста тромбоцитарного происхождения (PDGFR). Ростовые факторы, активируя ТКР, оказывают митогенное действие на клетки опухоли, проангиогенное влияние на эндотелий и перициты, а также изменяют состав опухолевого микроокружения. Наиболее весомым подкреплением этих теоретических выкладок служит доказанная в проспективных исследованиях эффективность мультикиназных ингибиторов [6–9].

Удивительно, но несмотря на то, что воздействие на HIF-зависимые сигнальные пути уже пришло в клиническую практику, особенности экспрессии и прогностической роли ростовых факторов и тирозинкиназ у больных ПКР изучены мало. Завершенные работы, как правило, посвящены исследованию ТКР на опухолевых клетках и эндотелии. Лимфоциты периферической крови теоретически могут быть вовлечены в процессы взаимодействия иммунной системы и проангиогенных HIF-зависимых сигналов при раке почки. В доступной нам литературе мы не обнаружили данных об экспрессии ТКР на периферических лимфоцитах.

Целью настоящего исследования является изучение экспрессии VEGFR, FGFR и PDGFR на субпопуляциях лимфоцитов периферической крови у здоровых добровольцев и больных ПКР до и после удаления первичной опухоли.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Характеристика больных ПКР и здоровых добровольцев

В исследование были включены 19 больных ПКР рТ1-Т3N0/N+M0/M+, подвергнутых нефрэктомии, и 10 здоровых добровольцев. Медиана возраста больных ПКР составила 59,0 (33–75) лет, соотношение мужчин и женщин — 1,1 : 1. Большинство (17 (89,5%)) пациентов имели опухоль одной почки, у 2 (10,5%) больных были диагностированы двухсторонние опухоли. Медиана размеров опухоли составила 7,8 (2,5–19,0) см. В 13 (44,8%) случаях имелся опухолевый венозный тромбоз. У 9 (47,4%) пациентов до операции выявлены отдаленные метастазы, в том числе солитарные в 4 (21,1%) случаях. У 2 (21,1%) больных метастазы локализовались более чем в одном органе. Метастатическое поражение легких имело место в 6 (31,6%), надпочечников — в 4 (21,1%), костей — в 1 (5,3%) наблюдении.

Всем пациентам была выполнена нефрэктомия с расширенной лимфодиссекцией. В 13 (44,8%) наблюдениях произведена тромбэктомия. Пяти (26,4%) больным удалены метастатические очаги: в 4 (21,1 %) случаях выполнена адреналэктомия по поводу метастаза в надпочечнике, в 1 (5,3%) — удаление костного метастаза. Полное удаление всех определяемых опухолевых очагов удалось осуществить в 13 (68,4%) случаях, у 6 (31,6%) пациентов операция имела циторедуктивный характер.

Гистологическое исследование во всех случаях подтвердило наличие ПКР. В 15 (78,9%) образцах верифицирован светлоклеточный, в 4 (21,1%) — несветлоклеточный вариант опухоли. Степень анаплазии G1–2 имела место в 13 (68,4%), G3–4 — в 6 (71,6%) препаратах. У 2 (10,5%) пациентов опухоль прорастала в паранефральную клетчатку. Во всех 13 образцах ткань удаленного тромба была представлена разрастаниями ПКР, аналогичного первичной опухоли. Опухолевые очаги в удаленных надпочечниках и резецированной костной ткани имели строение метастазов ПКР.

Все пациенты, повергнутые радикальному хирургическому лечению, находились под динамическим наблюдением. После циторедуктивной нефрэктомии все 6 больных были классифицированы в группу промежуточного прогноза (согласно критериям IMDC) и получали противоопухолевое лечение: цитокины — 1 пациент (5,3%), анти-VEGF таргетную терапию — 5 (26,3 %).

В исследование включено 10 здоровых доноров женского пола. Медиана возраста — 40,4 ± 7,4 (23–65) года.

Выделение лимфоцитов

Образцы крови собирали однократно у здоровых доноров и дважды —у больных ПКР (непосредственно перед и через 180 дней после хирургического вмешательства). Сбор крови производили в пробирки с покрытием EDTA (BD Biosciences). Периферические лимфоциты выделяли из цельной крови с использованием Ficoll-PaquePlus (GE Healthcare) и отделяли центрифугированием в течение 25 минут при 400 g. Клеточный осадок ресуспензировали в свежей среде RPMI 1640 (Gibco). Изолированные периферические лимфоциты были подготовлены для проточной цитометрии, как было описано ранее [10].

Проточная цитометрия

Изолированные периферические лимфоциты изучались непосредственно после выделения. Клетки инкубировали в течение 15 мин при 4°С с нормальными мышиными иммуноглобулинами (mIgG) (6 мкг мкг/106 клеток) (Invitrogen, ThermoFisherScientific), затем инкубировали с меченными флуорохромом антителами к поверхностным антигенам в течение 30 мин при 4°С (FITC анти-CD45, клон HI30, PE анти-VEGFR2, клон 7D4–6, PE анти-PDGFRα, клон 16. A1, PE анти-PDGFRß, клон 18. A2 (все Sony Biotech), PE анти-VEGFR1, клон D-2, PE анти-FGFR2, клон C-8 (SantaCruz Biotech). Клетки получали на проточном цитометре NovoCyte 2000R (ACEA Biosciences) и анализировали с использованием программного обеспечения NovoExpress v. 1.2.4. Для обеспечения строгого одноклеточного стробирования дублеты были исключены с использованием SSC и FSC высоты и ширины согласно рекомендациям сети проточной цитометрии. На всех этапах были использованы соответствующие контроли изотипа. Медиану интенсивности флуоресценции (MFI) рассчитывали путем вычитания значения флуоресценцию соответствующего изотипического контроля из значения флуоресценции исследуемого маркера.

Методы статистической обработки данных

Все данные пациентов были внесены в базу данных на основе электронных таблиц Microsoft Excel с помощью специально разработанного кодификатора. Анализ данных осуществлялся с применением блока статистических программ

SPSS Statistics 19. Для оценки взаимосвязи признаков рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона (r) и проводили оценку его значимости. Для сравнения качественных параметров применялся точный критерий Фишера и χ2 с учетом непараметрических данных и нормального распределения Пуассона. Различия признавали значимыми при p < 0,05. Общую выживаемость рассчитывали от даты хирургического вмешательства до смерти, безрецидивную выживаемость — от даты радикального хирургического вмешательства до даты регистрации рецидива, выживаемость без прогрессирования — от даты циторедуктивного хирургического вмешательства до даты регистрации прогрессирования ПКР. Выживаемость оценивали по методу Каплана-Майера, различия выживаемости определяли с помощью log-rank теста.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Производилась оценка экспрессии ТКР на лимфоцитах периферической крови CD45+, СD3+, CD8+ у больных раком почки до и через 180 дней после нефрэктомии, а также на лимфоцитах периферической крови CD45+у здоровых добровольцев.

Выявлено, что на мембране лимфоцитов периферической крови CD45+, а также субпопуляций лимфоцитов CD3+ и CD8+у больных ПКР, не получавших лечения, экспрессируются VEGFR1, VEGFR2, PDGFRα и β, FGFR2. Различий уровней экспрессии ТКР между субпопуляциями лимфоцитов у пациентов с ПКР не выявлено (p < 0,05 для всех) (табл. 1).

Лимфоциты периферической крови CD45+ здоровых добровольцев также экспрессировали VEGFR1, VEGFR2, PDGFRα и β, FGFR2. Отмечена достоверно более высокая экспрессия рецепторов тирозинкиназ, включая VEGFR1 и VEGFR2, PDGFRα и β, FGFR2 на CD45+ лимфоцитах периферической крови здоровых добровольцев по сравнению с больными ПКР, которым не удалена первичная опухоль (р < 0,05 для всех; табл. 2).

При изучении динамики уровней экспрессии ТКР у больных ПКР выявлена достоверно более высокая экспрессия VEGFR1 и VEGFR2 на CD45+лимфоцитах периферической крови через 180 дней после удаления первичной опухоли по сравнению с исходными значениями (р < 0,05 для всех). Наличие неудаленных метастазов не влияло на динамику экспрессии VEGFR1, VEGFR2 (табл. 3).

Через 180 суток после нефрэктомии отмечено достоверное увеличение уровня экспрессии VEGFR2 на CD3+ (р = 0,003) и CD8+ (р = 0,003) лимфоцитах периферической крови больных ПКР до и через 180 суток после нефрэктомии (табл. 1). Других значимых изменений продукции ТКР не выявлено.

Проведен корреляционный анализ, направленный на выявление статистически значимых взаимосвязей экспрессии VEGFR1, VEGFR2, PDGFRα, β, FGFR2 на лимфоцитах периферической крови (CD45+, CD3+, CD8+) с характеристиками рака почки (категории T, N, M, степень анаплазии G,

Таблица 1. Экспрессия рецепторов тирозинкиназ на CD45+, CD3+, CD8+ лимфоцитах периферической крови у больных раком почки до и через 180 суток после нефрэктомии

Экспрессия, средняя ± σ Больные раком почки, до операцииa Больные раком почки, 180 суток после нефрэкто-мииа 2-сторонняя значимость Периферические лимфоциты CD45+ VEGFR-1 28,8 ± 2,7 43,4 ± 5,9 0,001 VEGFR-2 27,1 ± 2,2 57,8 ± 7,4 0,002 PDGFRα 44,9 ± 3,7 49,1 ± 10,1 0,546 PDGFRβ 62,6 ± 3,8 47,4 ± 9,8 0,768 FGFR-2 41,4 ± 6,3 35,1 ± 2,8 0,223 Периферические лимфоциты CD3+ VEGFR-1 39,6 ± 5,4 52,6 ± 6,0 0,128 VEGFR-2 36,2 ± 4,4 64,5 ± 7,8 0,003 PDGFRα 52,9 ± 5,3 52,9 ± 10,2 0,997 PDGFRβ 69,2 ± 6,1 50,3 ± 9,0 0,090 FGFR-2 48,9 ± 8,9 38,0 ± 3,1 0,329 Периферические лимфоциты CD8+ VEGFR-1 34,0 ± 5,1 47,1 ± 6,3 0,122 VEGFR-2 30,9 ± 3,8 59,4 ± 8,4 0,003 PDGFRα 49,9 ± 4,9 52,8 ± 11,1 0,801 PDGFRβ 66,3 ± 5,4 49,5 ± 9,6 0,121 FGFR-2 47,8 ± 8,0 36,3 ± 2,8 0,252 а – не выявлено достоверных различий экспрессии VEGF-1, -2, PDGFRα, β, FGFR2 между субпопуляциями лимфоцитов периферической крови до и после нефрэктомии.

Таблица 2. Экспрессия рецепторов тирозинкиназ на CD45+ лимфоцитах периферической крови у здоровых добровольцев и больных раком почки до нефрэктомии

Экспрессия, средняя ± σ Здоровые добровольцы (n 10) Больные раком почки, до операции (n 19) 2-сторонняя значимость VEGFR-1 78,1 ± 4,7 28,8 ± 2,7 0,001 VEGFR-2 79,6 ± 5,1 27,1 ± 2,2 0,002 PDGFRα 80,1 ± 3,9 44,9 ± 3,7 0,012 PDGFRβ 75,5 ± 3,7 62,6 ± 3,8 0,045 FGFR-2 72,1 ± 3,1 41,4 ± 6,3 0,001 а – не выявлено достоверных различий экспрессии VEGF-1, -2, PDGFRα, β, FGFR2 между субпопуляциями лимфоцитов периферической крови до и после нефрэктомии.

инвазия паранефральной клетчатки и наличие опухолевого венозного тромбоза). Отмечена значимая обратная взаимосвязь уровней экспрессии VEGFR1 и VEGFR2 на CD45+, CD3+, CD8+ лимфоцитах периферической крови у больных ПКР до лечения с категорией Т, а также наличием опухолевого венозного тромбоза (табл. 4). Других значимых корреляций не выявлено.

Таблица 3. Экспрессия рецепторов тирозинкиназ на CD45+лимфоцитах периферической крови у больных раком почки до и через 180 суток после радикальной и циторедуктивной нефрэктомии

Экспрессия на CD45+, средняя ± σ Больные раком почки до операции (n 19) Больные раком почки после радикальной нефрэктомии (n 13) Больные раком почки после циторедуктивной нефрэктомии (n 6) VEGFR-1 28,8 ± 2,7 43,4 ± 8,9а 39,3 ± 0,8а VEGFR-2 27,1 ± 2,2 58,0 ± 9,4а 57,3 ± 14,3а PDGFRα 44,9 ± 3,7 51,3 ± 12,1 44,7 ± 21,7 PDGFRβ 62,6 ± 3,8 47,0 ± 11,5 48,3 ± 21,8 FGFR-2 41,4 ± 6,3 32,8 ± 2,7 39,7 ± 6,9 а – различия достоверны по сравнению с экспрессией РТК на CD45+ лимфоцитах периферической крови у больных раком почки до удаления первичной опухоли.

Медиана наблюдения за 19 больными ПКР составила 24,0 месяца. Рецидивы ПКР зарегистрированы у 4 (25,0%) из 16 радикально оперированных больных. Из 19 пациентов 13 (68,4%) живы (из них 9 (47,4%) — без признаков болезни, 4 (21,1%) — с метастазами), 6 (31,5%) умерли от прогрессирования ПКР. Медиана общей и специфической выживаемости всех пациентов составила 33,8 и 33,8 месяца; медиана безрецидивной выживаемости радикально оперированных больных не достигнута (2-летняя — 66,7%); медиана выживаемости без прогрессирования нерадикально оперированных больных равнялась 11 месяцев. Зависимости уровней и видов экспрессии ТКР на периферических лимфоцитах и исхода заболевания не получено (все p < 0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ

Насколько мы можем судить, это первое исследование, направленное на изучение экспрессии HIF-зависимых тирозинкиназ на лимфоцитах периферической крови у больных ПКР. Объектом исследования выбраны клетки, продуцирующие CD45, а также наиболее часто выявляемые в первичной опухоли и периферической крови пациентов, страдающих ПКР, субпопуляции лимфоцитов, экспрессирующих CD3 и CD8 [11,12].

Нами получены весьма неожиданные и многообещающие результаты. Мы доказали, что периферические лимфоциты экспрессируют VEGFR1, VEGFR2, PDGFRα, β, FGFR2. Функция ТКР на лимфоцитах периферической крови неизвестна.

Мы продемонстрировали, что экспрессия VEGFR1, VEGFR2, PDGFRα, β, FGFR2 на периферических лимфоцитах CD45+ у больных ПКР с неудаленной первичной опухолью достоверно ниже, чем у здоровых добровольцев (р < 0,05 для всех). При этом более низкая экспрессия

Таблица 4. Корреляция экспрессии рецепторов тирозинкиназ на CD45+, CD3+, CD8+ лимфоцитах периферической крови до операции с характеристиками первичной опухоли у больных раком почки

Уровень экспрессии маркеров на лимфоцитах периферической крови	Корреляция Пирсона (r), 2-сторонняя значимость (Sig. 2-s.)	Категория T	Опухолевый тромб
VEGFR-1 CD45+	r	–0,551*	–0,706**
	Sig. 2-s.	0,014	0,001
VEGFR-2 CD45+	r	–0,503*	–0,619**
	Sig. 2-s.	0,028	0,005
VEGFR-1 CD3+	r	–0,931**	–0,957**
	Sig. 2-s.	0,000	0,000
VEGFR-2 CD3+	r	–0,791**	–0,760**
	Sig. 2-s.	0,004	0,007
VEGFR-1 CD8+	r	–0,901**	–0,947**
	Sig. 2-s.	0,000	0,000
VEGFR-2 CD8+	r	–0,749**	–0,841**
	Sig. 2-s.	0,008	0,001

** – корреляция значима на уровне 0,01 (2-сторон.).

* – корреляция значима на уровне 0,05 (2-сторон.).

VEGFR1 и VEGFR2 на CD45+, CD3+, CD8+ лимфоцитах периферической крови у пациентов до лечения коррелировала с большей местной распространенностью первичной опухоли (высокой категорией Т, а также наличием опухолевого венозного тромбоза). Однако через 180 суток после нефрэктомии (независимо от наличия отдаленных метастазов) было отмечено достоверное нарастание экспрессии VEGFR1, VEGFR2 на CD45+ и VEGFR2 — на CD3+ и CD8+ лимфоцитах периферической крови по сравнению с исходными значениями (р < 0,05 для всех). Нам не удалось доказать влияние гипоэкспрессии ТКР на периферических лимфоцитах на прогноз больных ПКР, что может быть связано с малой выборкой исследования.

Таким образом, можно предположить, что развитие ПКР сопровождается выраженным подавлением экспрессии ТКР на периферических лимфоцитах. При этом степень снижения экспрессии HIF-зависимых тирозинкиназ прямо коррелирует с распространенностью опухолевого процесса. Удаление первичной опухоли приводит к нормализации экспрессии ТКР на периферических лимфоцитах. Интересно, что еще в 1995 г. Fujimoto K. et al. показали, что у больных ПКР повышается уровень растворимого сывороточного FGF2, который полностью нормализуется через 2 суток после нефрэктомии [13]. Нельзя исключить связи между ранними находками и результатами нашей работы. Полученные данные открывают перспективу разработки маркера, который мог бы использоваться для диагностики и наблюдения за больными ПКР, а также для возможных доклинических исследований препаратов [14].

Таким образом, периферические лимфоциты больных раком почки экспрессируют VEGFR1, VEGFR2, PDGFRα, β, FGFR2. Уровень продукции ТКР на CD45+ и клетках субпопуляций СD3+ и CD8+ не различается. Отмечается достоверно более низкая экспрессия VEGFR1, VEGFR2, PDGFRα, β и FGFR2 на CD45+ лимфоцитах периферической крови больных ПКР, которым не удалена первичная опухоль, по сравнению со здоровыми донорами. Более низкая экспрессия VEGFR1 и VEGFR2 на CD45+, CD3+, CD8+ лимфоцитах периферической крови у больных ПКР до лечения коррелирует с высокой категорией Т, а также наличием опухолевого венозного тромбоза. У больных раком почки через 180 суток после нефрэктомии (независимо от наличия неудаленных отдаленных метастазов) отмечается достоверное нарастание экспрессии VEGFR1, VEGFR2 на CD45+ и VEGFR2 — на CD3+ и CD8+ лимфоцитах периферической крови по сравнению с исходными значениями. Полученные данные требуют дальнейшего изучения и открывают перспективу разработки маркера рака почки.

Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (грант № 19-15-00442).