Экспрессионный профиль и молекулярно-генетический анализ синовиальной саркомы и саркомы Юинга/PNET

Проблема морфологической диагностики мягкотканных сарком существует уже на протяжении десятилетий, и это обусловлено несколькими обстоятельствами. Группа сарком мягких тканей гетерогенна, что объясняется их широкой гистоге-нетической вариабельностью. Саркомы различных гистогенетических типов часто структурно сходны между собой, и при микроскопическом изучении лишены специфических черт. Все это требует комплексного подхода патолога в исследовании опухоли с обязательным привлечением иммуногистохимического анализа [2].

Однако существует ряд сарком, при которых постановка точного нозологического диагноза затруднительна даже при использовании полного общепринятого стандарта. Так, среди мелкокруглоклеточных опухолей у патолога особенные трудности вызывает дифференциальная диагностика саркомы Юинга/PNET и низкодифференцированного субтипа синовиальной саркомы. Для них характерна схожая морфология – опухоли представлены популяцией мелких однотипных клеток округлой формы с одинаковыми ядерными характеристиками, с возможным присутствием розеток и подобных им структур, с минимальной тканевой дифференцировкой [2, 4, 9]. Для дифференциации указанных опухолевых процессов S.H. Olsen et al. [10] на большой серии наблюдений с использованием широкой панели моноклональных антител разработали метод кластерного анализа иммуногистохимического профиля сарком, заключающийся в совокупной оценке различия экспрессии маркеров и их интенсивности при той или иной саркоме. Между тем данный метод не обладает абсолютными критериями, разграничивающими саркому Юинга/PNET и синовиальную саркому низкодифференцированного субтипа.

При иммуногистохимическом исследовании саркомы Юинга/PNET и низкодифференцированного субтипа синовиальной саркомы иммунофенотип опухолей часто не демонстрирует четких различий – специфичность таких маркеров, как CD99, cytokeratin-AE1/AE3, cytokeratin-7, -19, EMA, Bcl-2, весьма относительна или полностью утрачивается [1, 2, 4, 9, 11]. В этой связи, когда исчерпываются возможности методов морфологической и иммуногистостохимической диагностики, решение вопроса лежит в плоскости молекулярногенетического анализа. Факт наличия специфических транслокаций как при саркоме Юинга/PNET (EWSR1), так и при синовиальной саркоме (SYT) позволяет прибегнуть к проведению FISH (CISH)-метода с целью точной верификации опухоли.

Поскольку иммунофенотип саркомы Юинга/ PNET и низкодифференцированной синовиальной саркомы вариабелен, представляют интерес его сопоставления с процентом опухолевых клеток, имеющих специфические для этих процессов транслокации.

Материал и методы

Исследовались 14 случаев сарком мягких тканей, из которых саркома Юинга/PNET составила 5 и синовиальная саркома – 9 случаев. Материал опухоли фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, заливали в парафин и готовили срезы толщиной 4–5 мкм. Срезы окрашивали в водном растворе гематоксилина и эозина. При гистологическом исследовании изучали цитотипические характеристики, типы структур опухолевого роста, распространенность и характер опухолевого матрикса, вторичные дистрофические изменения опухоли. Оценку митотической активности опухоли осуществляли посредством определения митотического индекса – подсчета митотических фигур в десяти полях зрения при большом увеличении объектива.

С целью определения иммунофенотипа сарком проводили иммуногистохимическое исследование. Использовались моноклональные антитела к следующим антигенам: vimentine (clone V9, «Novocastra»), desmin (clone DE-R-11, «Novocastra»), SMA (clone 1A4, «Dako»), Myf-4 (clone LO26, «Novocastra»), MyoD1 (clone 5.8A, «Dako»), S-100 (поликлональные, «Dako»), CD57 (clone NK-1, «Novocastra»), bcl-2 (clone bcl-2, «Dako»), CD99 (Ewing ′ s Sarcoma Marker) (clone 12E7, «Dako»), cytokeratine AE1/AE3 (clone AE1/AE3. «Dako»), cytokeratine 7 (clone OV-TL12/30, «Novocastra»), EMA (clone GP1.4, «Novocastra»), Syn-aptophysin (clone SY38, «Dako»), chromogranin (clone 5H7, «Novocastra»), Ki67 (clone MIB-1, «Dako»). Демаскировка антигенов (в тех случаях, где была необходима) проводилась в программируемой барокамере Pascal («Dako»). Инкубация с антителами составляла 30 мин при 25 °С. Применяли полимерную систему визуализации EnVision Flex High pH («Dako»). Срезы докрашивали гематоксилином.

Материалом для реакции хромогенной гибридизации in situ служили парафиновые срезы тканей, фиксированных в 10 % формалине. После стандартной процедуры депарафинизации срезы обрабатывались с помощью Paraffin Pretrreatment Reagent Kit II («Abbot Molecular», США) по протоколу фирмы производителя. Для выявления клеток, несущих транслокации, характерные для синовиальной саркомы и саркомы Юинга/PNET, проводилась гибридизация тканей с пробами SPOT-Light SYT Translocation Probe Pair и SPOT-Light Ewing ′ s Sarcoma Translocation Probe Pair (Invitrogen, США) соответственно. Реакция гибридизации проводилась в приборе TermoBrite Hybritizer («StatSpin», США). Детекция транслокаций осуществлялась с использованием набора SPoT-Light CISH Detection Kit («Invitrogen», США). После окраски срезов ткани гематоксилином («Invitrogen», США) проводилась оценка полученных результатов с использованием световой микроскопии.

Ядро, содержащее два спаренных сигнала, учитывалось как не несущее транслокацию; ядро, содержащее один спаренный и два одиночных сигнала, учитывалось как имеющее транслокацию. Ядра, наложенные друг на друга, имеющие нечеткие контуры, пузыри и сомнительные сигналы, не учитывались. Подсчет производился на 100 клеток, количество ядер, имеющих транслокацию, выражалось в процентах к общему числу учтенных ядер. Положительными (т.е. соответствующими идентифицируемой саркоме) считались образцы, имеющие ≥10 % ядер, несущих транслокацию.

Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистики. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия Манна – Уитни. Статистически значимыми различия считались при р < 0,05. Значения р < 0,2 рассматривались как тенденция.

Результаты исследования

По совокупности результатов гистологического, иммуногистохимического и молекулярногенетического исследований были сформулированы окончательные нозологические диагнозы. В 4 из 5 случаев саркома Юинга/PNET была представлена классическим (мелкокруглоклеточным) и одним веретеноклеточным вариантами. При иммуногистохимическом исследовании в большинстве случаев опухолевые клетки экспрессировали Bcl-2, CD99, слабо экспрессировали CD57, экспрессия АЕ1/ АЕ3 отсутствовала. За исключением одного случая пролиферативная активность опухолевой ткани была высокой – количество клеток с экспрессией Ki-67 составляло более 30 %. Все случаи саркомы Юинга/PNET были подтверждены молекулярногенетическим методом. Так, одним из основных признаков принадлежности опухоли к вышеуказанному семейству является генетическая перестройка с участием гена EWS (22q12). Продуктом данного гена является белок длиной 656 аминокислот с неясной функцией [7, 10]. Метод гибридизации in situ c использованием специального зонда позволяет выявить точку разрыва в локусе 22q12, т.е. с его помощью можно диагностировать не только основную транслокацию t(11;12)(q24;q12), но и остальные перестройки с участием минорных партнеров гена EWS. В результате проведенного CISH-исследования было показано, что доля клеток, несущих транслокацию t(11;12)(q24;q12), колебалась от 11 до 57 %.

Обсуждение

В настоящее время установлено, что хромосомная транслокация t(X;18)(р11.2;q11.2) в синовиальных саркомах определяется с частотой от 95 до 98 %. В результате транслокации происходит слияние гена SYT (SS18) с одним из генов – членов семейства SSX-SSX1, SSX2 или SSX4, с образованием нового химерного онкогена SYT/SSX. Белковый продукт SYT/SSX играет важную роль в формировании опухолевого фенотипа синовиальной саркомы [3–5, 8].

Проведенные нами исследования показали, что во всех случаях синовиальной саркомы имел место низкодифференцированный субтип, из них 4 случая представлены мелкокруглоклеточным фенотипом, 3 – веретеноклеточным и 1 случай – плеоморфноклеточным. Пролиферативная активность была высокой – количество клеток с экспрессией Ki-67, за исключением одного случая, составило более 20 %. Доля клеток, несущих транслокацию t(X;18) (р11.2;q11.2), варьировала от 12 до 64 %.

При синовиальной саркоме проведен анализ взаимосвязи показателей гистологических и иммуногистохимических признаков с количеством клеток, несущих транслокацию (таблица). Так, синовиальные саркомы, обладающие большим количеством клеток, несущих транслокацию t(X;18)(р11.2;q11.2), характеризуются тенденцией к слабой экспрессии bcl-2, к большему значению критерия G по системе FNCLCC – G3 и высокой митотической активностью. Данное обстоятельство позволяет думать, что синовиальные саркомы с высоким процентом клеток, несущих специфическую транслокацию, являются биологически более агрессивными опухолями. Кроме того, выраженная митотическая активность, а также отсутствие или слабая экспрессия bcl-2 предполагают большую чувствительность данных опухолей к химиотерапии.

В исследуемый массив (n=14) не вошли 2 случая сарком мягких тканей, в которых при проведении метода хромогенной in situ гибридизации наряду с клетками, несущими специфическую транслокацию (SYT), были обнаружены клетки, несущие другие хромосомные аберрации. В одном случае, помимо 5 % клеток с транслокацией t(X;18) (р11.2;q11.2), 12 % клеток имели del(18q11.2). В литературе отсутствуют данные об интерпретации подобных генетических нарушений при синовиальной саркоме, поэтому диагноз был сформулирован как «недифференцированная веретеноклеточная саркома G2». В другом случае опухоль имела бифазное строение (веретеноклеточный и железистый компонент). При анализе веретеноклеточного компонента транслокация обнаружена в

Таблица

Взаимосвязь гистологических и иммуногистохимических признаковс количеством клеток, несущих транслокацию

54 % опухолевых клеток, из них в 25 % на фоне амплификации сигнала. В 13 % клеток обнаружены ядра с амплификацией сигнала без транслокации. В железистом компоненте транслокация обнаружена в 37 % опухолевых клеток, из них в 8 % на фоне амплификации сигнала. В 23 % клеток обнаружены ядра с амплификацией сигнала без транслокации. В этом случае процесс квалифицирован как «бифазный субтип синовиальной саркомы».

Настоящее исследование демонстрирует объективные трудности диагностики, с которыми приходится сталкиваться патологу в повседневной практике. В случаях, когда иммуногистохимическое исследование не позволяет дифференцировать мелкоклеточные варианты саркомы Юинга/PNET и синовиальной саркомы, значимость CISH (FISH)-метода достаточно велика. Однако тот факт, что специфические транслокации встречаются в 95 % синовиальной саркомы и в 85 % случаев саркомы Юинга/PNET [6], а также выявление иных генети- СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2014. № 2 (62)

ческих аберраций при этих процессах накладывают определенные ограничения на интерпретацию результатов гибридизации in situ. Кроме того, показана определенная связь морфологии и иммунофенотипа синовиальной саркомы с процентом опухолевых клеток, имеющих специфическую транслокацию. Дальнейшие исследования позволят выяснить, имеет ли процент клеток, несущих транслокацию t(X;18)(р11.2;q11.2), предсказательное значение для оптимизации лечения синовиальных сарком.