Экспрессионный профиль микроРНК при плоскоклеточном раке головы и шеи

Клиническое течение плоскоклеточных карцином головы и шеи (ПКГШ) отличается высокой агрессивностью и длительным бессимптомным развитием, местные рецидивы ПКГШ и метастазы в лимфоузлы шеи сокращают 5-летнюю выживаемость пациентов практически вдвое [6]. Для улучшения результатов лечения важно определить риск развития рецидива опухоли и метастазов до их клинической реализации, что требует поиска и разработки новых прогностических маркеров заболевания. Предложено много новых белковых маркеров для прогнозирования течения ПКГШ: матриксные металлопротеиназы и их ингибиторы, протеасомная и кальпаиновая системы [5, 14]. Активно ведется поиск новых биомаркеров ПКГШ с использованием протеомных [1, 2] и транскриптомных технологий [3]. Открытие нового класса малых некодирующих РНК – микроРНК (миРНК) (~22 нуклеотида) определило новое направление в онкологии. МиРНК, комплементарно связываясь с 3’ концевым районом гена, модулируют экспрессию белок-кодирующих генов, причем как одна миРНК имеет более десятка генов-мишеней, так и один ген может находиться под контролем нескольких миРНК. К настоящему времени показано, что миРНК не только ассоциированы с различными типами опухолей, но могут сами выступать в роли онкогенов и супрессоров новообразований, т.е. быть первопричиной злокачественных превращений наряду с соматическими мутациями в генах [10]. Анализ литературных данных о роли миРНК в канцерогенезе при ПКГШ показал, что для оценки возможности их использования в качестве маркеров или терапевтических мишеней необходимы дальнейшие исследования.

Цель исследования – поиск новых диагностических маркеров путем изучения профилирования экспрессии миРНК в образцах ткани пациентов с плоскоклеточными карциномами гортани на основе выявления ассоциативной связи между выбранными миРНК (миРНК-21, -221, -222, -155, -205, -20a, -125b, -146b, -181b, -200a, -126, -451) и клиникоморфологическими параметрами заболевания.

Материал и методы

В работе представлены результаты исследования операционного и биопсийного материала, полученного от 60 пациентов с верифицированным диагнозом плоскоклеточной карциномы разной степени дифференцировки: T1N0M0 (n=14), T2N0M0 (n=14), T3N0M0 (n=15), T4N0M0 (n=8), T3–4N0–3M0–1 (n=9), поступивших на лечение в отделение опухолей головы и шеи Томского НИИ онкологии. Средний возраст больных – 53 ± 5,3 года. Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ № 2288, от 24.12.93), получено разрешение этического комитета Томского НИИ онкологии.

Для хранения и транспортировки операционного материала использовался раствор для стабилизации РНК RNAlater, позволяющий выделять РНК из тканей и клеток без замораживания в жидком азоте. Выделение суммарного пула РНК проводили с помощью набора «РеалБест экстракция 100» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрация и качество выделенной РНК оценивались на спектрофотометре NanoDrop 2000C (ThermoScientific, США). Чистоту препарата оценивали как отношение поглощения при длинах волн 260 нм/280 нм и 260 нм/230 нм. Для чистой РНК соотношение A260/280– 2,8, А260/230 – 1,8–2,2. Обратная транскрипция была проведена при помощи специфичных праймеров к миРНК: hsa-miR-21, hsa-miR-221, hsa-miR-222, hsa-miR-155, hsa-miR-205, hsa-miR-20a, hsa-miR-125b, hsa-miR-146b, hsa-miR-181b, hsa-miR-200a, hsa-miR-126, hsa-miR451. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием готовой реакционной смеси «РеалБест Мастер микс ОТ» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Полученную кДНК, в объеме 3 мкл, сразу использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР.

Измерение уровней экспрессии миРНК проводили методом ПЦР в реальном времени на амплифика-торе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США) [8]. В качестве референсного гена использовали малую РНК U6. Реакцию ПЦР проводили в объеме 30 мкл с использованием готовой реакционной смеси «РеалБест Мастер микс» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск) и раствора прямого и обратного праймеров (5 мкМ) и зонда (2.5 мкМ). Статистическая обработка проводилась с применением непараметрического U-критерия Манна – Уитни в программе Statistica 10.0.

Результаты и обсуждение

Профилирование экспрессии миРНК у больных ПКГШ T1–4N0M0 стадии

Геном человека насчитывает около 1 900 генов миРНК. Для одной миРНК характерно более 100 генов-мишеней (Release 21, http://www.mirbase. org/). В зависимости от их роли в процессе канцерогенеза все миРНК разделены на онкогены и онкосупрессоры. В то же время одна миРНК может выступать как в роли онкогена, так и в роли опухолевого супрессора в зависимости от её гена-мишени и ткани, в которой она экспрессируется. На основе базы mirBase, анализа литературных и собственных экспериментальных данных выбраны миРНК, относящиеся к «онкомиру» и характерные для большинства видов карцином. Анализ уровня экспрессии выбранных 12 миРНК в опухолевых образцах, взятых у больных с плоскоклеточной карциномой гортани T1–4N0M0 стадии, показал увеличение уровня экспрессии 9 миРНК: миРНК -21, -221, -22, -155, - 205, -146b, -181b, -200a, -126, -451 – и снижение уровня экспрессии трех миРНК: миРНК -20a, -125b, -200a (рис. 1).

Мы полагаем, что выявленные незначительные различия уровней экспрессии миРНК -221, -222, -205, -20a, -125b, -146b, -200a в опухоли и прилежа-

Рис. 1. Изменение экспрессии миРНК в образцах ПКГШ по сравнению с неизмененной тканью: столбцы черного цвета обозначают медианное значение миРНК для группы неизмененной ткани, столбцы серого цвета – медианное значение миРНК для группы опухолевой ткани. * – различия статистически значимы в опухолевой ткани по сравнению с неизмененной тканью (p<0,05); ** – различия статистически значимы в опухолевой ткани по сравнению с неизмененной тканью (p<0,001)

щей неизменённой ткани являются характерными для ПКГШ, в отличие от опухолей других локализаций [4]. Нами наблюдалось увеличение уровня экспрессии миРНК-21 в опухоли по сравнению с неизмененной тканью более чем в 3 раза (p<0,001). МиРНК-21 является онкогеном с множеством доказанных мишеней-онкосупрессоров [16], и ее экспрессия повышена в различных злокачественных опухолях [4], в том числе и при ПКГШ [13]. Мы наблюдали увеличение уровня экспрессии миРНК-155 более чем в 2 раза в опухолевой ткани в сравнении с неизмененной тканью (p<0,05). МиРНК-155 также является онкогеном, играет важную роль в различных биологических процессах, таких как гемопоэз, дифференцировка, воспаление, рак [15, 20]. Экспрессия миРНК-155 повышена практически во всех типах рака, включая ПКГШ [21]. Уровень миРНК-181b был увеличен почти в 3 раза в опухолевой ткани по сравнению с неизмененной тканью (p<0,001). Согласно литературным данным, миРНК-181b обладает различными свойствами в зависимости от типа ткани, в которой она экспрессируется. Так, в клетках глиомы человека миРНК-181b является онкосупрессором и участвует в регуляции апоптоза опухолевых клеток [17]. В ПКГШ миРНК-181b является онкогеном и играет важную роль в злокачественной трансформации клеток [7, 18]. В представленной работе показано увеличение уровня миРНК-126 в опухолевой ткани более чем в 5 раз по сравнению с неизмененной тканью (p<0.001). МиРНК-126 является онкосупрессором, а также участвует в процессах ангиогенеза [11]. X. Yang et al. показали, что экспрессия миРНК-126 in vitro значительно снижает пролиферацию клеток, прогрессию клеточного цикла и инвазию [19]. Кроме того, миРНК-126 регулирует многие аспекты эндотелиальной клеточной биологии, включая миграцию клеток, реорганизацию цитоскелета, стабильность капиллярных сетей, и требуется для поддержания сосудистой системы [12]. Уровень миРНК-451 был увеличен более чем в 7 раз (p<0.05) по сравнению с неизмененной тканью. Возможно, это связано с участием миРНК-451 в процессах инвазии [9].

Профилирование экспрессии миРНК у больных ПКГШ T3–4N0–3M0–1 стадии

На втором этапе работы проводилось сравнение экспрессии выбранной группы миРНК у больных c ПКГШ T3–4N0M0 (n=23) и T3–4N0–3M0–1 (n=9). Анализ профиля миРНК в сравнительных группах выявил тенденцию к увеличению уровня экспрессии всех исследуемых миРНК. Однако статистически значимое различие наблюдается только для миРНК-126 (p<0,05) (рис. 2). Вероятно, повышение уровня миРНК-126 в образцах тканей больных с ПКГШ T3–4N0–3M0–1 стадии по сравнению с T3–4N0M0 связано со способностью регулировать процессы ангиогенеза и миграцию клеток. Полученные результаты говорят о перспективности использования миРНК-126 в качестве маркёра метастазирования при ПКГШ.

Заключение

Выявленные изменения уровней экспрессии выбранной группы миРНК позволили сформировать профиль миРНК, характерный для ПКГШ, который может отражать процессы, происходящие в опухолевой ткани во время прогрессирования данного заболевания. Учитывая различия в содержании миРНК-126 в опухолях у больных с наличием и без метастазов в регионарные лимфоузлы (p<0,05), мы полагаем, что этот показатель может быть важным для понимания процессов метастазирования и разработки нового прогностического маркёра.

Рис. 2. Изменение экспрессии миРНК в образцах у больных с ПКГШ T3–4N0M0 стадии по сравнению с больных с ПКГШ T3–4N0–3M0–1 стадии:

столбцы черного цвета обозначают медианное значение миРНК для опухолевой ткани при ПКГШ T3–4N0M0 стадии, столбцы серого цвета – медианное значение миРНК для опухолевой ткани при ПКГШ T3–4N0–3M0–1 стадии; * – различия статистически значимы по сравнению с группой больных без метастазов (p<0,05)