Экзосомы и формирование резистентного фенотипа опухолевых клеток

Общие представления об экзосомах

Микровезикулы, позже названные «экзосома‑ ми», впервые были обнаружены при изучении про‑ цесса созревания ретикулоцитов. Первоначально микровезикулы не рассматривались в качестве механизма межклеточной коммуникации, им отво‑ дилась в основном функция вывода метаболитов из клеток в окружающее их пространство [1, 2]. К середине 1990‑х годов прошлого века появляются статьи, описывающие роль экзосом в реализации процессов лактации, формирования очага вос‑ паления, иммунного ответа и нейроактивности [3–5]. Было установлено, что они также участвуют в патогенезе диабета, тромбоза, в развитии и про‑ грессировании нейродегенеративных и онкологи‑ ческих заболеваний [6–8].

Регуляция механизма формирования и секреции экзосом, а также сортинга их молекулярного соста‑ ва до сих пор остается малоизученной областью. Процесс образования экзосом осуществляется путем инвагинации мембраны поздней эндосомы с последующим формированием и созреванием мультивезикулярного комплекса (МВК). Затем

МВК либо сливается с лизосомами, где происходит переработка всего содержимого эндосомы, либо встраивается в плазматическую мембрану и высво‑ бождает экзосомы в межклеточное пространство [9] . В процессе формирования экзосом из эндосом они сохраняют топологию плазматической мембра‑ ны клетки, что позволяет им инкорпорироваться в окружающие клетки [10]. Так, например, мембрана экзосом включает представителей семейства те‑ траспонинов (CD63, CD81, CD82, CD9 и CD37), флотиллин, мононенасыщенные жирные кислоты и холестерин, формирующие липидные рафты [11, 12]. Среди молекул, общих для большинства экзо‑ сом, также можно выделить: белки теплового шока (Hsp60, Hsp70, Hsp90 и др.), мембраносвязанные малые ГТФазы и аннексин; белки, участвующие в образовании МВК (ALIX, TSG101 и клатрин); белки цитоскелета (например, актин и тубулин) и сигнальной трансдукции (протеинкиназы и гетеро‑ тримерные G‑белки) [13]. Согласно Exocarta , в экзосомах, продуцируемых различными типами клеток, идентифицировано 41 860 белков, более 7 540 РНК и 1 116 липидов.

Интерес исследователей к экзосомам суще‑ ственно возрос после того, как была обнаружена способность экзосом инкорпорироваться и пере‑ носить свое содержимое в клетки‑реципиенты. Установлено, что опухолевые клетки продуцируют экзосомы в значительно большем количестве, чем нормальные клетки. Продуцируемые клетками опухолей экзосомы обнаруживаются практиче‑ ски во всех биологических жидкостях организма, включая сыворотку крови, мочу, сперму, асцитные и плевральные жидкости. За счет присутствия на своих мембранах адгезионных рецепторов и лиган‑ дов, специфичных для различных типов клеток и тканей, экзосомы «прицельно» взаимодействуют с определенными типами клеток, доставляя в по‑ следние биологические молекулы самого широко‑ го спектра действия, в том числе факторы роста, цитокины, рецепторы, биоактивные липиды и различные виды РНК [14–16].

В последние годы информация о биологиче‑ ских свойствах опухолевых экзосом (онкосом) приобретает лавинообразный характер. Прежде всего, следует отметить одно из ключевых свойств опухолевых экзосом – способность инициировать опухолевую трансформацию или формирование опухолеподобного фенотипа клеток окружаю‑ щей ткани. Продемонстрирована трансформация стволовых клеток жировой ткани под действием экзосом клеток рака предстательной железы [17], злокачественная трансформация фибробластов, нокаутных по гену BRCA1, под действием экзосом из плазмы крови онкологических больных [18], трансформация нормальных фибробластов в при‑ сутствии микровезикул из клеток рака молочной железы и трансформированных фибробластов [19]. Трансформирующий эффект экзосом опосредован целым рядом микроРНК: miR‑125b, miR‑130b, miR‑155 [17], miR‑21 [20], мРНК K‑ras, H‑ras и онкобелками, в том числе семейства Ras [17].

Другим, не менее важным свойством опухоле‑ вых экзосом является способность индуцировать опухолеподобный фенотип в клетках окружаю‑ щей стромальной ткани, в частности конверсию нормальных фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток в опухоль‑ассоциированные фибробласты [21–23]. Получены доказательства участия экзосом в регуляции инвазии и метастази‑ рования опухолей [24, 25], формировании премета‑ статических ниш [26–28], ангиогенезе [20, 29].

Как известно, устойчивость к различного рода повреждающим и цитостатическим агентам явля‑ ется одной из универсальных характеристик зло‑ качественных новообразований. Развернувшиеся в последнее время исследования экзосом показали, что формирование резистентного фенотипа опухо‑ левых клеток происходит в том числе с участием экзосом, которые благодаря свой природе могут обеспечивать распространение резистентности по всему пулу опухолевых клеток. Ниже будут более подробно рассмотрены различные варианты резистентности опухолей и значение микровезикул в формировании ответа клеток на повреждающие стимулы.

• 1.    Экзосомы и лекарственная устойчивость опухолевых клеток

• 2.    Экзосомы и облучение

Если говорить о роли микровезикул в форми‑ ровании резистентного фенотипа опухолевых кле‑ ток, то, безусловно, одной из наиболее изученных областей является участие экзосом в развитии множественной лекарственной устойчивости. Как известно, в основе феномена множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), столь харак‑ терного для опухолевых клеток самого различного происхождения, лежит активация АВС‑транспорте‑ ров - белков, обеспечивающих АТФ‑зависимый выброс ксенобиотиков из клетки [30, 31]. Дли‑ тельный контакт клеток с химиопрепаратами при‑ водит к гиперэкспрессии генов МЛУ (наиболее известные из них - гены MDR1, MDR2 и др.), ко‑ дирующих соответствующие АВС‑транспортеры, и развитию резистентности опухолевых клеток к химиопрепаратам [31, 32].

Открытие микровезикул и их способности к межклеточному переносу биомолекул поставило перед исследователями новые вопросы и основной из них – не могут ли экзосомы способствовать распространению резистентности по всей попу‑ ляции опухолевых клеток. Действительно, рядом независимых лабораторий была продемонстри‑ рована способность микрочастиц, полученных от резистентных клеток, вызывать соответствующие изменения в клетках‑реципиентах. Так, в экспе‑ риментах на культивируемых in vitro клетках рака молочной железы было показано, что микрочасти‑ цы, выделенные из резистентных клеток, содержат повышенное количество Р‑гликопротеина, одного из основных АВС‑транспортеров, и добавление таких экзосом к чувствительным клеткам приво‑ дит к накоплению экзогенного Р‑гликопротеина в клетках и существенному повышению лекарствен‑ ной резистентности [33, 34]. Дальнейшее развитие этих исследований позволило существенно рас‑ ширить список биомолекул, входящих в состав микрочастиц резистентных клеток и способных индуцировать лекарственную резистентность в клетках‑реципиентах. В первую очередь это от‑ носится к микроРНК, регулирующим уровень экс‑ прессии генов МЛУ. Так, в экзосомах резистентных клеток были идентифицированы miR‑27a и miR‑ 451, ассоциированные с развитием МЛУ [35]. Но микроРНК, опосредующие экзосом‑зависимую резистентность, могут непосредственно и не уча‑ ствовать в регуляции генов МЛУ - когда в числе их мишеней оказываются гены (анти)апоптотического сигналинга. Подобный эффект был обнаружен для miR‑222, микроРНК широкого спектра действия, одной из мишеней которой является PTEN – фосфатаза, блокирующая антиапоптотический PI3K‑сигналинг [36]. Другая обнаруженная в экзо‑ сомах микроРНК (miR‑433) приводит к развитию лекарственной устойчивости через подавление в клетках‑реципиентах синтеза белка ретинобласто‑ мы и CDK6 (cyclin‑dependent kinase 6) [37]. Про‑ демонстрировано участие miR‑100‑5p в развитии лекарственной устойчивости через регуляцию mTOR‑сигналинга [38].

Оказалось, что индуцировать лекарственную устойчивость в опухолевых клетках могут не только экзосомы резистентных клеток, но и эк‑ зосомы, продуцируемые клетками опухолевой стромы. В экспериментах на опухолях яичника было обнаружено, что экзосомы, продуцируемые опухоль‑ассоциированными фибробластами, спо‑ собны вызывать лекарственную резистентность в близлежащих опухолевых клетках за счет переноса miR‑21, блокирующей экспрессию APAF1 (apop‑ totic protease‑activating factor 1) [39].

Следует отметить, что не только микроРНК, но и кодирующие мРНК могут переноситься микрочастицами. Так, экзосомы, секретируемые клетками глиобластомы, обогащены мРНК, ко‑ дирующими ферменты ДНК репарации: MGMT (O(6)‑methylguanine DNA methyltransferase) и APNG (alkylpurine‑DNA‑N‑glycosylase), и перенос этих мРНК в клетки‑реципиенты может существен‑ но повышать уровень резистентности [40]. Экзосо‑ мы резистентных клеток обогащены и собственно мРНК, кодирующими АВС‑транспортеры. В част‑ ности, подобный эффект продемонстрирован для экзосом, секретируемых клетками химиорези‑ стентного варианта остеосаркомы MG‑63DXR30: в экзосомах таких клеток обнаружено повышенное содержание мРНК Р‑гликопротеина и показан пере‑ нос мРНК в составе экзосом в клетки‑реципиенты с последующим снижением чувствительности клеток к доксорубицину [41].

Если суммировать данные об участии микроча‑ стиц в распространении лекарственной резистент‑ ности, можно выделить два основных момента: 1) не вызывает сомнений, что микрочастицы, про‑ дуцируемые опухолевыми клетками с повышенным уровнем МЛУ, могут индуцировать резистентность в клетках‑реципиентах; 2) развитие подобной ин‑ дуцированной de novo резистентности напрямую связано с уникальным составом «резистентных» донорских экзосом. Вероятно, в разных случаях решающим фактором могут служить либо накопле‑ ние в экзосомах самих АВС‑транспортеров, либо соответствующих микроРНК и мРНК, а скорее все‑ го - комплекс этих факторов, что в итоге приводит к формированию и поддержанию резистентного фенотипа в клетках‑реципиентах.

Учитывая столь широкий спектр действия экзо‑ сом, можно ожидать, что не только множественная лекарственная устойчивость, ассоциированная с активацией АВС‑транспортеров, но и устойчивость к препаратам направленного действия развивается с участием микрочастиц. Действительно, было по‑ казано, что в развитии резистентности опухолей почки к ингибиторам тирозинкиназ, в частности сунитинибу, принимают участие экзосомы, обо‑ гащенные некодирующей РНК lncARSR (lncRNA Activated in RCC with Sunitinib Resistance) [42]. Чувствительность клеток хронического миелолей‑ коза к другому ингибитору тирозинкиназ – имати‑ нибу – снижается при действии на клетки экзосом, полученных от иматиниб‑резистентных клеток. Авторы показали, что этот эффект опосредован микроРНК miR‑365, блокирующей экспрессию про‑апоптотических белков в клетках‑реципиентах [43]. В наших экспериментах исследовался меха‑ низм резистентности клеток рака молочной железы к метформину, цитостатическое действие кото‑ рого связано с активацией АМРК и подавлением mTOR‑сигналинга активность [44]. Мы показали, что экзосомы от метформин‑резистентных клеток отличаются уникальным протеомным профилем и вызывают частичное развитие резистентности в клетках‑реципиентах [45]. В целом, представляется достаточно вероятным, что резистентность опухо‑ левых клеток к таргетным препаратам, во многих случаях связанная с ремодуляцией внутриклеточ‑ ных сигнальных путей, может распространяться между клетками, в том числе с помощью экзосом, вызывающих стойкие изменения сигнальных путей в клетках‑мишенях.

Если участие микрочастиц в формировании лекарственной резистентности опухолевых клеток на сегодняшний день не вызывает сомнений, то роль микрочастиц в регуляции ответа клеток на облучение исследована существенно в меньшей степени. Известны лишь отдельные работы, в которых продемонстрировано участие микровези‑ кул в развитии реакции опухоли на облучение, и результаты этих исследований достаточно противо‑ речивы. В первую очередь это связано с хорошо известным в радиобиологии эффектом «свидетеля» (bystander effect) - радиоиндуцированными изме‑ нениями, передающимися от облученных клеток необлученным. Предполагается, что в основе этого эффекта лежит передача индуцированных или модифицированных облучением биометаболитов (активные формы кислорода, цитокины, ростовые факторы, фрагменты нуклеиновых кислот и др.) необлученным клеткам либо паракринным пу‑ тем, либо через межклеточные щелевые контакты [46–48]. В последние годы появились работы, в которых в экспериментах как на нормальных, так и на опухолевых клетках молочной железы получены прямые доказательства участия экзосом облучен‑ ных клеток в индукции радиационных изменений (в первую очередь, генетической нестабильности, сокращения теломер) в необлученных клетках [49,

• 50] . Вместе с тем экзосомы облученных клеток могут обладать и протективными свойствами, в частности, в экспериментах на клетках плоскокле‑ точного рака головы и шеи описана способность экзосом от облученных клеток существенно уве‑ личивать скорость пролиферации необлученных клеток, как полагают авторы, в результате актив‑ ного накопления в экзосомах облученных клеток ферментов ДНК репарации [51].

• 3.    Экзосомы и гормональная резистентность

• 4.    Экзосомы: перспективы клинического использования при лечении резистентных форм рака

Другой, не менее важный вопрос - в какой мере микрочастицы и экзосомы могут влиять на ис‑ ходный уровень радиочувствительности опухолей и, учитывая их протективные свойства, способ‑ ствовать распространению радиорезистентности на опухолевую популяцию. Исследования в этом направлении только начинаются, и можно рас‑ считывать, что в скором времени удастся получить ответы и на этот, и на другие вопросы, касающиеся роли экзосом в реакции опухоли на облучение.

Гормональная терапия (ГТ) относится к одно‑ му из наиболее распространенных видов лечения гормонозависимых злокачественных новообразо‑ ваний, в первую очередь опухолей репродуктив‑ ной системы: рака молочной железы, яичника, эндометрия, предстательной железы. В основе гормональной терапии лежит принцип создания искусственного дефицита гормонов, необходимых для роста гормонозависимых опухолей - эстро‑ генов (для опухолей женской репродуктивной системы) и андрогенов (для опухолей предстатель‑ ной железы), что достигается в основном двумя способами: снижением концентрации эндогенных гормонов за счет подавления их синтеза (ингиби‑ торы ароматазы) или замещением гормонов их неактивными аналогами (антиэстрогенами или антиандрогенами). Несмотря на безусловную эффективность, применение ГТ ограничено раз‑ витием резистентности опухолей к гормонам, которая может носить врожденный характер либо развиваться в процессе гормонотерапии.

Механизм гормональной резистентности до‑ статочно хорошо изучен. В отличие от МЛУ раз‑ витие гормональной резистентности не связано с активацией АВС‑транспортеров, а вызвано либо необратимым блоком гормональной сигналинга (как правило, подавлением активности или син‑ теза специфических внутриклеточных рецепторов гормонов), либо активацией рост‑регулирующих сигнальных путей, идущих в обход гормонозависи‑ мого сигналинга. Помимо уменьшения содержания рецепторов, среди основных факторов, приводя‑ щих к гормональной резистентности, различают: нарушение баланса между белками‑активаторами и супрессорами рецептора, лиганд‑независимую активацию рецептора; стимуляцию сигнальных путей, идущих в обход рецепторов гормонов (в первую очередь, тирозинкиназных рецепторов) и поддерживающих тем самым рост опухолей в отсутствие гормонов [52–55]. Один из наиболее известных примеров такой активации – гиперэк‑ спрессия в клетках рака молочной железы Her2/ Neo, представителя семейства тирозинкиназных рецепторов, контролирующего пролиферацию клеток в отсутствие эстрогенов [56, 57]. Кроме того, к сигнальным белкам, гиперэкспрессиро‑ ванным в резистентных клетках, относятся белки, подавляющие активность рецептора эстрогенов (NF‑kB) или препятствующие лиганд‑зависимой активации рецептора (Akt, РАК1) [58–60]. Мы показали, что к негативным регуляторам эстро‑ генового рецептора относится Snail1, ключевой белок эпителиально‑мезенхимального перехода, и продемонстрировали эффект активации рецептора при подавлении Snail1 [61].

Существенно меньше известно относительно роли межклеточных взаимодействий в разви‑ тии гормональной резистентности опухолей. В работах по исследованию межклеточных кон‑ тактов обнаружено, что эффективность ответа клеток рака молочной железы на антиэстроген тамоксифен возрастает при активации щелевых межклеточных контактов [62], продемонстриро‑ вано, что в клетках, резистентных к тамоксифену, активность межклеточных контактов снижена [63]. Безусловно, с началом активного изучения биологической роли микрочастиц начались ис‑ следования участия микровезикул в развитии и поддержании гормональной резистентности опухо‑ левых клеток. Установлено, что в распространении гормональной резистентности от резистентных на чувствительные клетки рака молочной железы могут принимать участие экзосомы, секретируе‑ мые резистентными клетками [64, 65]. В наших исследованиях в экспериментах на эстрогензави‑ симых клетках рака молочной железы MCF‑7 и тамоксифенрезистентной сублинии MCF‑7/T по‑ лучены прямые доказательства распространения резистентности от резистентных к чувствительным клеткам и продемонстрировано непосредственное участие экзосом в развитии приобретенной рези‑ стентности [66, 67].

При сравнительном анализе карго экзосом резистентных клеток идентифицированы отдель‑ ные некодирующие РНК, определяющие развитие гормональной резистентности в клетках‑донорах. Среди них - представители семейства lncRNA (long non‑coding RNA), в частности - UCA1 (Urothelial carcinoma‑associated1) [64] и отдельные предста‑ вители микроРНК. Среди последних - микроРНК 221/222, обладающая широким спектром действия, накопление которой в клетках приводит к развитию резистентности к химио‑ и гормональным препа‑ ратам [36, 65].

Достаточно убедительно продемонстрирова‑ но участие микроРНК в развитии гормональной резистентности опухолей. Это, прежде всего, микроРНК, участвующие в негативной регуляции рецептора эстрогенов - miR‑342 [68], Let7b/Let‑7i [69], mir‑1280 [70] и др. Кроме того, в регуляции эстрогенового сигналинга принимают участие микроРНК, мишенью которых являются белки‑ коактиваторы/корепрессоры рецептора эстрогенов, в частности Mir‑17‑5p, регулирующая экспрессию коактиватора SRC‑3 [71], mir‑10, мишенью которой является ядерный корепрессор NCOR2 [72]; miR‑ 451, регулирующая экспрессию сигнальных белков HER2, EFGR и MAPK [73], mir‑101, участвующая в регуляции Akt сигналинга в резистентных клетках [74]. Среди белков‑онкосупрессоров особое место занимает PTEN, являющийся мишенью для целого ряда микроРНК, ассоциированных с гормональной резистентностью [36, 75, 76]. Показано, что как минимум некоторые из этих микроРНК могут пере‑ носиться экзосомами [77], что свидетельствует об их потенциальном значении в межклеточном рас‑ пространении гормональной резистентности.

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в терапии рака, развитие химиорезистентности остается центральной проблемой. Антрациклины являются основными препаратами при проведении химиотерапии, и их эффективность непосредствен‑ но зависит от способности опухоли формировать «защитные» механизмы, поддерживающие вы‑ живаемость злокачественных клеток. В настоящее время не существует валидированных специфиче‑ ских маркеров, позволяющих точно предсказать индивидуальную чувствительность пациента к конкретному препарату из ряда антрациклинов. Какими свойствами должны обладать такие марке‑ ры? Маркеры должны быть высоко специфичны и своевременно отражать развитие резистентности к терапии. Биологические свойства циркулирующих экзосом, описанные выше, делают их вполне востре‑ бованными для разработок в этом направлении.

Содержимое экзосом опухолевых клеток представлено широким спектром молекул, среди которых возможно выявить ферменты, участвую‑ щие в реализации действия химиопрепаратов, и, таким образом спрогнозировать ответ на терапию. Исследования, завершенные в 2018 г., свидетель‑ ствуют о диагностической ценности экзосомаль‑ ных белков для прогноза метастазирования при немелкоклеточном раке легкого [78]. В качестве маркеров метастазирования, содержащихся в экзо‑ сомах, авторы рассматривают белки, связывающие липополисахарид. Активно исследуется значение экзосомальных АВС‑транспортеров и микроРНК, ассоциированных с лекарственной/гормональной устойчивостью, для прогноза эффективности те‑ рапии злокачественных опухолей [79–81].

Внедрение экзосом в клиническую практику протекает достаточно активно. Результаты по‑ иска по базе данных клинических исследований clinicaltrials.gov ключевых слов «exosomes» и «cancer» содержат более 30 проектов, при этом 21 исследование находится в стадии набора па‑ циентов. Запущен ряд проектов, нацеленных на оценку эффективности терапии онкологических заболеваний. В исследование NCT03109873 будут включены пациенты с опухолями головы и шеи, получающие метформин, перспективный бигуанид с выраженной противоопухолевой активностью. Авторы планируют выявить влияние метформина на экзосомальный профиль больных, что должно позволить сформировать критерии для оценки прогноза и эффективности терапии. Экзосомы на‑ ходят применение не только как средства доставки и возможный источник маркеров [78, 91], но и как кандидаты для проведения сопровождающей терапии. В исследовании NCT01668849 рассма‑ тривается возможность использования экзосом, выделенных из винограда, для снижения побочных эффектов радио‑ и химиотерапии при опухолях головы и шеи.

Таким образом, в последние годы накоплены обширные сведения о корреляциях белкового/ ДНК/(микро)РНК профиля экзосом и с развити‑ ем резистентного фенотипа опухолевых клеток. Новаторские исследования экзосом открывают ряд уникальных возможностей для онкологии, и дальнейшие шаги должны помочь внедрить неко‑ торые из смелых экспериментальных разработок в клиническую практику.

Заключение

Открытие экзосом и, главное, их способности переносить биологический материал от клетки к клетке во многом изменило представления о механизме опухолевой трансформации и про‑ грессировании. Прежде всего, это обнаружен‑ ная способность экзосом вызывать опухолевую трансформацию и/или индуцировать опухолепо‑ добный фенотип в клетках окружающей ткани; стимулировать ангиогенез, образование премета‑ статических ниш, индуцировать эпителиально‑ мезенхимальный переход и др. И, конечно, одно из наиболее значимых достижений в этом на‑ правлении - влияние экзосом на формирование резистентного фенотипа клеток. Экзосомы дей‑ ствительно могут обеспечивать распространение резистентности от резистентных к чувствитель‑ ным клеткам за счет во многом еще непонятного механизма, основанного на переносе в клетки специфических регуляторных молекул: белков‑ транспортеров, микроРНК, мРНК и др. Если раньше в развитии приобретенной резистентности опухолей центральное место отводилось селек‑ ции предсуществующих или возникших de novo клеток с выраженной устойчивостью, то после от‑ крытия экзосом все большее внимание уделяется