Электрофоретический анализ запасных белков семян в межвидовых скрещиваниях гороха

Материал и методика исследований

В эксперименте изучали сорта и линии Р . sativum ssp. sativum : Стабил ( усатый тип листа , af ), 102b ( усатый тип листа , af), ПАП ( многократно непарноперистый морфотип , aftl ), а также образцы P. fulvum И 609881 и И 609885 коллекции ВИР . Межвидовую гибридизацию проводили в условиях тепличного бокса . Гибриды гороха оценивали c использованием морфологических и белковых маркеров .

Для выделения и электрофоретического разделения белков семян сорта Стабил , линий и гибридов F₁ и F₂ применяли стандартный арбитражный метод ISTA [13]. Производили анализ компонентного состава запасных белков отдельных семян . Белки экстрагировали из муки в течение 20 часов при температуре 3-4º С с помощью электродного буфера ( ТРИС , глицин , додецил сульфат натрия ), рН =8,3. После центрифугирования 10 мкл экстракта переносили в ячейку планшетки , где смешивается с равным объемом буфера нанесения ( додецил сульфат натрия , ТРИС -HCl, глицерин , β - меркаптоэтанол , бромфеноловый синий ). Концентрация разделяющего геля – 12,5%, концентрирующего – 5%.

Позиции белковых компонентов гороха определяли по реперным компонентам спектра сои сорта Ланцетная . Интенсивность окрашивания компонентов спектров оценивали как : 1 – слабую , 2 – интенсивную и 3 – очень интенсивную .

Результаты и их обсуждение

Межвидовые гибриды гороха получены в комбинациях скрещивания : 102b × И 609881, Стабил × И 609881, ПАП × И 609885 при использовании P. fulvum в качестве отцовского компонента . Линия 102b и сорт Стабил характеризовались усатым типом листа и белой окраской цветков ( рис . 1). Растения линии ПАП представляли многократно непарноперистый морфотип с белыми цветками . Гибриды F₁ во всех комбинациях имели обычную форму листа и нежно малиновую окраску лепестков цветков .

В комбинации ПАП × И 609885 проведено одно успешное скрещивание . В комбинации 102b × И 609881 гибриды получены в результате скрещивания 3 из 27 цветков (11,1%). Эффективность получения гибридов в комбинации Стабил × И 609881 составила 46,7% (7 успешных скрещиваний из 15).

На электрофоретических спектрах гибридов F 1 102b × И 609881 присутствовали 6 характерных (7, 8, 46, 50, 57, 71) белковых компонентов образца И 609881 и 4 компонента (40, 42, 58, 60) линии 109b ( табл . 2).

В спектрах гибридов F 1 Стабил × И 609881 отмечено наличие 7 характерных для образца И 609881 компонентов (7, 19, 20, 21, 41, 45, 46) и 3 компонента сорта Стабил (42, 60, 66).

Компоненты P. fulvum 7, 41, 46 и Р . sativum 42 имели одинаковое распределение в двух комбинациях скрещивания . Процент совпадения компонентов образца P. fulvum И 609881 с одинаковым распределением в двух комбинациях скрещивания составил 3/12=25. Для компонентов Р . sativum (109b и Стабил ) он равнялся 1/5=20.

Рисунок 1 - Цветки P. fulvum И609881 (слева) и гибрида F₁ 102b × И609881 (справа)

Средняя эффективность межвидовой гибридизации для всех комбинаций скрещивания составила 25,6%.

Сравнительный анализ компонентного состава спектров образцов P. fulvum И 609881 и И 609885

Образцы P. fulvum коллекции ВИР И 609881 и

И 609885 имели сходные спектры белковых компонентов с общим числом компонентов 69 и 68 соответственно . Образцы различались по наличию / отсутствию 7, 46 компонента и интенсивности окрашивания компонентов 15, 16, 23, 45, 54 ( табл . 1).

Таблица 1 – Вариабельные компоненты спектров образцов P. fulvum И609881 и И609885

Компонент	И 609881	И 609885
7	3
15	1	3
16	1	3
23	1	3
45	2	3
46	3
54	2	3

Компонентный состав электрофоретических спектров меж видовых гибридов гороха F₁

Анализ гибридов F 1 по белковым компонентам проводили в комбинациях скрещивания 102b × И 609881, Стабил × И 609881 ( рис . 2).

Рисунок 2 - Электрофореграмма запасных белков межвидового гибрида F₁ 102b × И609881: 1 - спектр сои, 2…6 - спектры P. fulvum , 7…10 - спектры P. sativum , 11…13 - спектры гибрида F₁ (слева направо)

Таблица 2 – Состав характерных компонентов запасных белков семян родителей и гибридов F1 109b × И609881 и Стабил × И609881

Компоненты	102b × И 609881			Стабил × И 609881
	P1     {	P2     {	F1	P1 {	P2     {	F1
Компоненты И 609881
7		3	3		3	3
8		1	3
19					3	3
20					3	3
21					3	3
41		3	3		3	3
45					3	3
46		3	3		3	3
48		3
50		3	3
57		3	3
71		2	2
Компоненты 109b и Стабил
40	1		1
42	3		3	3		3
58	2		2
60	1		1	3		3
66				3		3

Примечание: жирным курсивом обозначены совпадающие в двух комбинациях скрещивания компоненты.

Компонентный состав электрофоретических спектров меж видовых гибридов гороха F 2

Изучение компонентного состава спектров родителей и гибридов F₂ проводили в комбинации скрещивания : ПАП × И 609885. Компоненты у родителей и гибридов F₂ распределялись в интервале 5-104. Гибриды расщеплялись по компонентам 16, 24, 31, 41, 58 ( табл . 3). Следует отметить , что оба родителя характеризовались наличием компонентов 16, 31 и имели различия по компонентам 24, 41, 58.

Белок гороха представлен различными фракциями [14]. Фракция глобулинов включает три главные группы белка: вицилины (7S), конвицилины (7S) и легумины (11S). Нередуцированная молекула легумина характеризуется молекулярной массой 6065 кДа. В редуцирующих условиях (β-меркаптоэтанол) молекула легумина разделяется на кислую (35-43 кДа) и основную субъединицы (21-23 кДа), являясь производными одной молекулы. В гибридном поколении F2 наблюдали сопряженное расщепление компонентов с подвижностью 24 и 41. Расщепление компонентов 24 и 41 в соотношении 2,3:1 (Fфакт=0,13; F05=3,84) соответствовало гипотезе о моногенном наследовании. Если принять во внимание, что 22 компонент по соевой шкале содержит белок с молекулярной массой 65 кДа [13], то компонент 24 представляет нередуцированную молекулу легумина. Компонент 37 по соевой шкале весит 45 кДа, тогда молекулярная масса 41 компонента может указывать на его принадлежность к кислой субъединице легумина.

Таблица 3 – Распределения варьирующих компонентов в спектрах гибридов F2 ПАП × И609885

Линия , образец , гибрид	Компоненты
	16	24	31	41	58
ПАП	3	3	3		2
И 609885	3		3	3
Расщепление компонентов F 2 ПАП × И 609885
1	+		+
2		+		+	+
3	+	+	+	+
4		+		+	+
5		+	+		+
6	+	+		+
7	+		+	+	+
8	+	+	+	+	+
9		+		+
10	+		+		+

Примечание: жирным курсивом показано сопряженное расщепление компонентов.

В комбинациях скрещивания 102b × И 609881, Стабил × И 609881 компонент 41 являлся уникальным для P. fulvum . При этом компонент 42 был характерен только для Р . sativum . На основании этого можно предположить наличие разных аллелей легумина у P. fulvum и Р . sativum . Для точной идентификации принадлежности компонентов электрофоретических спектров к определенным группам глобулинов ( вицилин , конвицилин , легумин и др .) необходимо использовать маркеры молекулярной массы .

Электрофоретический спектр образца P. fulvum И 609881 характеризуется уникальным компонентом 7. Этот компонент наследуется в F₁ и независимо расщепляется в F₂.

Выводы

Получены межвидовые гибриды гороха в результате скрещивания сорта Стабил и линии ПАП (Pisum. sativum) с образцами Pisum fulvum коллекции ВИР. Образцы P. fulvum И609881 и И609885 имели сходные спектры белковых компонентов и различались по наличию/отсутствию и интенсивности окрашивания 6 компонентов. Истинность гибридов F1 P. sativum × P. fulvum подтверждена наличием компонентов обеих родительских форм . Дифференцированы маркерные компоненты P. fulvum (7, 41, 46) и Р. sativum (42) c одинаковым распределением у родителей и гибридов F1 в комбинациях скрещивания сорта Стабил и линии 109b P. sativum с образцом P. fulvum И609881. Гибриды F2 ПАП × И609885 расщеплялись по 5 компонентам. Образец P. fulvum И609881 характеризовался уникальным компонентом 7, который наследовался в F1 и независимо комбинировался в F2. В гибридном поколении F2 ПАП × И609885 наблюдали сопряженное расщепление компонентов с подвижностью 24 и 41. Высказано предположение об их принадлежности к легуминам .

Теоретический и научно - практический журнал . Основан в 2005 году

Свидетельство о регистрации ПИ №ФС77–21514 от 11.07. 2005 г.

Подписано в печать 28.12.2010 Формат 60х84/8. Бумага офсетная.

Гарнитура Таймс.

Объём 18,5 усл. печ. л. Тираж 300 экз. Издательство Орел ГАУ, 302028, г. Орел, бульвар Победы, 19.

Лицензия ЛР№021325 от 23.02.1999 г.

Ж урнал рекомендован ВАК Минобрнауки России для публикаций научных работ, отражающих основное научное содержание кандидатских и докторских диссертаций