Электрохимический способ получения ферментативных белковых гидролизатов из гидробионтов, используемых для приготовления микробиологических питательных сред

электролизе обеспечиваются необходимые значения величины рН и температуры для проведения процесса ферментативного гидролиза белоксодержащего сырья. Таким образом, создаются условия ферментолиза без использования агрессивных химических реагентов – кислот и щелочей, а нагрев реакционной среды осуществляется за счет выделения омического тепла при прохождении электрического тока через раствор электролита.

Для расщепления белоксодержащего сырья применяли ферментный препарат панкреатин с активностью 8*USP – 200 ед. (производства США).

Аминокислотный состав полученных белковых гидролизатов сравнивали с коммерческим панкреатическим гидролизатом рыбы производства ОАО "Протеин" (г. Мурманск) и панкреатическим гидролизатом рыбной муки производства НПО "Питательные среды" (г. Оболенск) ( Артюхин и др. , 1990; Телишевская , 2000; Мухин, Новиков , 2001).

Ферментативная электрохимическая технология состоит из следующих операций: измельчение сырья, смешение с раствором электролита, электроэнзиматический гидролиз в электролизере при заданной температуре и рН реакционной среды, термоинактивация фермента, отстаивание, декантация, отделение негидролизованного сырья и веществ липидной природы с помощью фильтрации и сушка.

Гидролиз сырья проводили в электролизере с инертными электродами при постоянном перемешивании и плотности тока 300-400 А/м2.

Для фильтрации использовали фильтровальную ткань-бельтинг и бумажные фильтры "белая лента".

Величину рН растворов определяли с помощью универсального иономера ЭВ-74.

Эффективность процесса ферментолиза белоксодержащего сырья определяли по степени гидролиза (отношение аминного азота к общему азоту – Nам./Nоб., %) и по изменению в процессе гидролиза содержания аминного азота в реакционной среде.

Химический состав полученных гидролизатов изучали согласно ГОСТу 7636-85.

Аминокислотный анализ полученных гидролизатов проводили методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием системы ВЭЖХ LC-10АVP ("Shimadzu Corp.", Япония) и колонки SupelcosilТМ LC-18 ("SUPELCO", США). Для регистрации продуктов, содержащих свободные аминогруппы, предварительно проводили их дериватизацию с помощью ортофталевого альдегида (Henderson et al., .

Оценку пригодности электрохимического панкреатического гидролизата рыбы для использования его в составе микробиологических питательных сред проводили согласно требованиям ФС 42-3378-97 в лаборатории ФГУ "Мурманский ЦСМ".

Рис. 1. Изменение концентрации аминного азота в процессе электроэнзиматического гидролиза рыбной муки и путассу

• 3.    Обсуждение результатов

Ферментативные        электрохимические гидролизаты были получены при тех же условиях, что и коммерческие ферментативные гидролизаты (ТУ-480-00001927-27-93). А именно, гидромодуль 1:1 (соотношение сырье:вода); электроэнзиматический гидролиз вели в течение 6 часов при температуре 48±2°C и рН 7.8-8.0; далее создавали в реакционной среде величину рН = 4.4-4.5, при этом выделившиеся белки (с ММ ≈ 67 кД) отделяли фильтрацией после 12-ти часового отстаивания; доводили величину рН среды до нейтральных значений, фильтровали и сушили. Затем был изучен химический и аминокислотный состав экспериментальных гидролизатов.

На рис. 1 показано изменение концентрации аминного азота в процессе ферментолиза, которое свидетельствует о скорости расщепления белковых молекул с образованием свободных аминокислот и пептидных фрагментов. Для достижения необходимой концентрации аминогрупп в конечном продукте (согласно ТУ-480-00001927-27-93) процесс ферментолиза белоксодержащего сырья необходимо вести 5-6 часов.

В табл. 1 приведены результаты химического и аминокислотного анализа ферментативных гидролизатов, полученных электрохимическим способом, и аналогичные показатели ферментативных гидролизатов, произведенных химическим методом, взятые из литературных источников.

Таблица 1. Химический и аминокислотный состав ферментативных гидролизатов, полученных традиционным химическим и электрохимическим способами

Показатель, %	Ферментативный химический гидролиз		Электроэнзиматический гидролиз
	Путассу / Панкреатин	РМ/ Панкреатин	Путассу / Панкреатин	РМ/ Панкреатин
N об. %	10.87	13.3	10.05	12.66
N ам. %	4.24	4.4	3.92	3.42
Степень гидролиза, %	39.0	33.1	39.0	27.5
NaCl, %	7.8		9.0	17.8
Содержание свободных аминокислот, %	21.49	19.5	23.28	20.9
Аспарагиновая	0.944	0.52	0.202	0.056
Глутаминовая	1.714	0.673	0.569	0.093
Серин	0.710	0.42	0.580	0.076
Гистидин	0.632	0.52	0.178	0.162
Глицин	0.248	0.20	1.422	0.583
Треонин	0.682	0.53	0.648	0.595
Аргинин	2.406	2.89	5.781	6.274
Аланин	1.528	1.02	1.659	0.429
Тирозин	1.566	1.35	1.84	0.895
Валин	1.092	1.29	1.055	0.194
Метионин	0.400	0.85	0.189	0.122
Триптофан	0.566	–	0.492	0.137
Изолейцин	–	1.04	0.716	0.376
Фенилаланин	2.052	2.14	1.53	1.315
Лейцин	4.244	2.96	5.144	2.782
Лизин	2.704	3.08	1.279	6.059

Содержание аминного и общего азота в сравниваемых гидролизатах практически одинаково, содержание NaCl не превышает допустимых значений (согласно ТУ-480-00001927-27-93). Степень гидролиза в ферментативных электрохимических гидролизатах составляет 27-40 %. Этот показатель соответствует высокой степени гидролиза белоксодержащего сырья и позволяет использовать полученные гидролизаты в микробиологии, как компоненты для приготовления питательных сред. Количество свободных аминокислот в электрохимических ферментативных гидролизатах на 5-10 % выше, чем в гидролизатах, полученных по ферментативной химической технологии ( Телишевская , 2000; Мухин, Новиков , 2001; Артюхин и др ., 1990) . Кроме того, данные гидролизаты характеризуются более высоким (в 0.5-2.5 раза) содержанием глицина, аргинина, лейцина в обоих гидролизатах; аланина, тирозина и лейцина в гидролизате из рыбы (путассу) и лизина в гидролизате из рыбной муки.

Низкое содержание аспарагиновой и глутаминовой кислот, по всей видимости, можно объяснить тем, что в щелочной среде происходит ионизация обеих карбоксильных групп, поэтому эти аминокислоты могут легко перемещаться в анодное пространство. Пониженное содержание серина, гистидина и метионина можно объяснить длительным электрохимическим процессом, при котором возможно их электрохимическое разложение, например, декарбоксилирование.

Для определения возможности использования ферментативных электрохимических гидролизатов рыбы и рыбной муки в составе питательных сред были приготовлены питательный бульон и питательный агар на их основе. Анализ микробиологической активности проводили путем сравнения роста шести тест-культур: Corynebacterium xerosis 1911 , Staphylococcus aureus Wood – 46 , Escherichia coli 055 K59 3912/41 , Pseudomonas aeruginosa 27/99 , Shigella flexneri la 8516 и Salmonella typhi H – 901 .

Качество питательного бульона на основе панкреатического гидролизата оценивали по следующим показателям: чувствительность к росту тест-культур; стабильность основных морфологических, культуральных, биохимических (образование индола и сероводорода) свойств; эффективность роста (выход биомассы с 1 мл среды). В качестве контрольной питательной среды использовали коммерческий питательный бульон (ГРМ-бульон), биологическое качество которого регламентируется ФС 42-3378-97.

Результаты чувствительности тест-культур на испытуемых средах приведены в табл. 2.

Таблица 2. Биологические показатели питательного бульона, приготовленного на основе электрохимического панкреатического гидролизата рыбы или рыбной муки и на основе коммерческого ГРМ-агара

Основа питательной среды	Кратность разведения	ТЕСТ-КУЛЬТУРЫ
		Corynebact erium. xerosis 1911	Escherihia Coli 055 K59 3912/41	Pseudomonas aeruginosa 27/99	Staphilo-coccus аureus Wood-46	Shigella Flexneri la 85/16	Salmonella typhi H-901
Электрохимич.	10-6	Рост	Рост	Рост	Рост	Индол	Н 2 S
панкреатич.	10-7	Рост	Рост	Рост	Рост	Индол	Н 2 S
гидролизат рыбной муки	10-8	Рост	Рост	Рост	Рост	Индол	Н 2 S
Электрохимич.	10-6	Рост	Рост	Рост	Рост	Индол	Н 2 S
панкреатич.	10-7	Рост	Рост	Рост	Рост	Индол	Н 2 S
гидролизат рыбы	10-8	Рост	Рост	Рост	Рост	Индол	Н 2 S
Коммерческий ГРМ-агар	10-6	Рост	Рост	Рост	Рост	Индол	Н 2 S
	10-7 10-8	Рост Рост	Рост Рост	Рост Рост	Рост Рост	Индол Индол	Н 2 S Н 2 S

Как видно из данных табл. 2, питательный бульон, приготовленный на основе панкреатических электрохимических гидролизатов рыбной муки и путассу, по чувствительности тест-культур полностью удовлетворяет требованиям ФС 42-3378-97 к их биологическому качеству и даже превосходит их, так как максимальное разведение, в котором испытуемые штаммы тест-культур давали рост, составляет 10^-8, что соответствует 10 КОЕ/мл. Shigella flexneri la 8516 сохраняла свою протеолитическую активность и образовывала индол, соответственно Salmonella typhi H-901 проявляла способность к образованию сероводорода.

Эффективность роста тест-культур или их всхожесть определяли на питательном агаре, для приготовления которого в качестве основы использовали гидролизат рыбной муки. Для сравнения и контроля количества засеваемого материала параллельно делали посев на коммерческий питательный агар, используемый для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. В качестве тест-культур применяли Corynebacterium xerosis 1911 , Staphylococcus aureus Wood – 46 , Escherichia coli 055 K59 3912/41 , Pseudomonas aeruginosa 27/99 .

Результаты посева тест-культур на питательный агар представлены в таблицах 3-4.

Как видно из данных, приведенных в таблицах 3 и 4, эффективность роста всех тест-культур на питательном агаре с использованием электрохимического панкреатического гидролизата рыбной муки сопоставима с всхожестью тест-культур на коммерческом питательном агаре. Эффективность роста тест-культур соответствует количеству микробных клеток в засеваемых объемах при пересчете на исходную взвесь, приготовленную по стандарту мутности на 10 единиц. Морфология колоний на питательном агаре с электрохимическим гидролизатом и на коммерческом питательном агаре является идентичной и соответствует паспортным данным тест-культур. Тест-культура Pseudomonas aeruginosa 27/99 продуцирует пигмент пиоцин сине-зеленого цвета при росте на обеих средах.

Таблица 3. Сравнительная характеристика эффективности роста тест-культур на питательном агаре с использованием гидролизата рыбной муки

Разведение и засеваемый объем	Питательный агар с коммерческим панкреатическим гидролизатом рыбной муки
	Escherichia coli 055 K59 3912/41	Pseudomonas aeruginosa 27/99	Corynebacterium xerosis 1911	Staphylococcus aureus Wood – 46
10-6 / 0.1 мл	0.6×108	6.4×108	8.2×108	3.3×108
10-7/ 0.5 мл	2.1×108	6.3×108	7.1×108	4.7×108
10-8/1.0 мл	2.0×108	5.0×108	1.1×108	2.5×108
Всего	1.5×108	5.9×108	8.8×108	3.5×108
	Питательный агар с электрохимическим панкреатическим гидролизатом рыбной муки
10-6 / 0.1 мл	1.2×108	8.3×108	7.4×108	3.9×108
10-7/ 0.5 мл	1.4×108	6.0×108	7.9×108	3.4×108
10-8/1.0 мл	1.0×108	0.5×108	1.1×108	4.0×108
Всего	1.2×108	7.9×108	8.7×108	3.8×108

Таблица 4. Сравнительная характеристика эффективности роста тест-культур на питательном агаре с использованием гидролизата рыбы

Разведение и засеваемый объем	Питательный агар с коммерческим панкреатическим гидролизатом рыбы
	Escherichia coli 055 K59 3912/41	Pseudomonas aeruginosa 27/99	Corynebacterium xerosis 1911	Staphylococcus aureus Wood – 46
10-6 / 0.1 мл	2.7×108	5.4×108	8.0×108	2.1×108
10-7/ 0.5 мл	2.3×108	5.0×108	9.5×108	1.3×108
10-8/1.0 мл	1.5×108	4.7×108	7.5×108	1.3×108
Всего	2.2×108	5.0×108	8.7×108	1.5×108
	Питательный агар с электрохимическим панкреатическим гидролизатом рыбы
10-6 / 0.1 мл	2.0×108	7.2×108	7.0×108	3.0×108
10-7/ 0.5 мл	3.5×108	6.5×108	5.6×108	2.3×108
10-8 / 1.0 мл	3.1×108	5.0×108	9.0×108	1.9×108
Всего	3.1×108	6.2×108	7.5×108	2.4×108

• 4.    Вывод

Применение процесса электролиза водных растворов неорганических солей для получения гидролизатов из рыбы и рыбной муки в присутствии фермента – панкреатина позволяет на 5-10 % увеличить выход свободных аминокислот. В полученных гидролизатах увеличивается содержание глицина, аргинина, лейцина.

Результаты микробиологических исследований подтверждают возможность использования электрохимических гидролизатов для приготовления микробиологических питательных сред. Питательные среды на их основе для большинства тест-культур показали большую чувствительность, чем на коммерческом гидролизате. Полученные питательные среды не имеют отклонений в морфологии колоний. Электрохимические панкреатические гидролизаты рыбы и рыбной муки полностью соответствует требованиям ФС 42-3378-97.