Электрополевое формирование биомиметического органоминерального покрытия на природной эмали человеческого зуба: морфология и поверхностные механические свойства

Original Empirical Research

Electric-Field-Assisted Formation of a Biomimetic Organomineral Coating on Natural Human Tooth Enamel: Morphology and Surface Mechanical Properties

Pavel V. Seredin¹ © В, Dmitry L. Goloshchapov¹ © , Tatyana A. Litvinova² © ,

Olga V. Dekhnich²   , Yury A. Ippolitov³

• ¹    Voronezh State University, Voronezh, Russian Federation

• ²    Belgorod National Research University, Belgorod, Russian Federation

• ³    N.N. Burdenko Voronezh State Medical University, Voronezh, Russian Federation

Introduction. The development of coatings capable of reproducing the structural and functional properties of dental enamel is of considerable interest for dental materials science and biomimetic surface engineering. Despite the progress achieved in biomimetic calcium-phosphate systems, the most common approaches still rely on multistep protocols that are highly sensitive to interfacial-layer formation conditions and do not always ensure simultaneous reduction of deposition time, control of coating morphology, and reproducible surface mechanical response. The objective of this study was to experimentally evaluate the feasibility of one-step formation of a biomimetic hybrid nHAp/PDA coating in an electric field using isolated electrodes, and to determine the effect of the deposition mode on surface morphology and the surface microhardness of the “coating–substrate” system.

Materials and Methods. Segments of native human permanent tooth enamel were used as a model of a natural apatitecontaining substrate. Four surface conditions were compared: native enamel, an nHAp/AA layer formed after acid conditioning, a PDA/nHAp coating obtained by sequential deposition, and a hybrid coating formed via simultaneous electric-field-assisted mineralization and accelerated dopamine polymerization. Deposition was performed in a potentiostatic cell with isolated copper electrodes. Surface morphology was evaluated using scanning electron microscopy and atomic force microscopy (AFM). Surface mechanical response was assessed by Vickers microhardness testing at a 50 g load, AFM mapping of indentation imprints, and local nanoindentation.

Results . The one-step electric-field-assisted mode was found to produce the densest and most uniform surface layer, approximately 1 μm thick, with a minimum roughness of about 20 nm. Sample D demonstrated the highest surface microhardness values, reaching approximately 310 VHN, whereas native enamel showed values of approximately 280 VHN, sample B — about 120 VHN, and sample C — about 190 VHN. One-way ANOVA confirmed a statistically significant effect of sample type on microhardness (p < 0.001). AFM mapping of the indentation imprints confirmed the accuracy of optical diagonal measurements on the textured surface.

Discussion. The increased surface microhardness of the electric-field-assisted sample appears to be associated with more organized interfacial interactions involving polydopamine and a denser packing of the mineral component of the coating. At the same time, Vickers microhardness testing and AFM nanoindentation characterize different scale levels of the mechanical response and should therefore be interpreted as complementary methods.

Conclusion. It is shown that one-step formation of a hybrid nHAp/PDA coating in an electric field using isolated electrodes makes it possible to obtain a morphologically organized layer with a surface mechanical response comparable to that of intact enamel. The proposed approach appears promising for the accelerated formation of functional organomineral coatings on apatite-containing substrates.

Acknowledgements. The authors would like to thank the Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), for providing access to equipment and related experimental infrastructure for SINS and s-SNOM experiments at the Imbuia beamline of Sirius (Proposal 20252761).

Funding Information. The study was supported by the Russian Science Foundation, project No. 26-15-20057,

Введение. Эмаль представляет собой высокоминерализованную иерархически организованную ткань, механические характеристики которой определяются ориентацией апатитовых кристаллитов, градиентом состава и структурной анизотропией [1] . Научная и прикладная значимость разработки покрытий, способных частично воспроизводить либо восстанавливать указанные характеристики, связана не только с задачами локальной регенерации твёрдых тканей зуба, но и с созданием управляемых биомиметических систем, в которых межфазная организация и механический отклик регулируются составом и режимом формирования покрытия [2] .

Современные подходы к реминерализации и получению эмалеподобных покрытий включают системы на основе функциональных неорганических материалов, органических матриц и полимерных носителей [3] . Отдельное направление представлено гидрогелевыми системами, позволяющими моделировать гелеобразную среду минерализации и контролировать локальную доставку ионов [4] . Значительный интерес представляет гидроксиапатит (nHAp) как функциональный материал, обладающий высокой биоактивностью и структурным сходством с минеральной фазой твёрдых тканей [5] . Клинические и материаловедческие обзоры подтверждают высокий потенциал гидроксиапатитсодержащих систем для профилактики повреждений и восстановления эмали [6] . Однако применение преимущественно минеральных систем не всегда обеспечивает устойчивую адгезию покрытия к поверхности эмали и контролируемую межфазную организацию на границе «покрытие - подложка», что ограничивает воспроизводимость морфологии и механических свойств формируемого слоя.

Вместе с тем полидофамин (PDA) рассматривается как один из наиболее универсальных межфазных компонентов благодаря выраженным адгезионным свойствам и способности инициировать связывание неорганической фазы с подложкой [7] . Современные обзоры, посвящённые химии полидофамина, показывают, что такие плёнки не только стабилизируют поверхность, но и формируют функциональную межфазу, способную направлять минералообразование [8] . Хотя схемы ускоренного осаждения с участием системы CuSO 4 /H₂O₂ позволяют существенно сократить время получения более однородного слоя [9] , проблема воспроизводимого управления морфологией и межфазной организацией гибридных покрытий остаётся актуальной. Для стоматологических применений важно, что PDA способен инициировать минералообразование на деминерализованной эмали [10] и усиливать реминерализа-ционный эффект в одностадийных покрытиях, сочетающих полидофамин и фторид-ион [11] . Показано также, что полидофаминовые покрытия влияют на характер нуклеации кальций-фосфатной фазы на поверхности минерализованных подложек [12] .

Вместе с тем альтернативные биомиметические матрицы, включая амелогениноподобные системы, способны направлять ориентированное формирование эмалеподобной минеральной структуры, однако, как правило, требуют более сложных многостадийных протоколов [13] . Электрокинетические подходы, напротив, улучшают транспорт ионов в толщу эмали, но сами по себе не решают задачу контролируемой межфазной организации гибридного покрытия [14] . В ранее выполненной авторами работе была показана возможность быстрого осаждения гибридных гидроксиапатит-полидофаминовых слоёв на природной эмали [15] . Однако вопрос о том, может ли одностадийное формирование покрытия в электрическом поле при изолированных электродах одновременно обеспечить сокращение времени осаждения, контролируемую морфологию и воспроизводимый поверхностный механический отклик, остаётся недостаточно изученным. Особый интерес представляет возможность более локализованного управления процессами осаждения и межфазного взаимодействия в условиях пространственного разделения электродных процессов, что потенциально позволяет повысить однородность и структурную организованность формируемого гибридного слоя.

Механика

Целью настоящей работы является экспериментальная оценка возможности одностадийного формирования гибридного nHAp/PDA-покрытия в электрическом поле с использованием изолированных электродов, а также установление влияния режима осаждения на морфологию поверхности и поверхностную микротвёрдость системы «покрытие - подложка».

Данное исследование отвечает на следующие вопросы.

• 1.    Обеспечивает ли одностадийный электрополевой режим более равномерное и структурно организованное покрытие по сравнению с последовательными схемами осаждения?

• 2.    Сопровождаются ли морфологические изменения поверхности ростом поверхностной микротвёрдости?

• 3.    Согласуются ли результаты микротвёрдости Виккерса и локального АСМ-наноиндентирования при оценке механического отклика сформированного гибридного слоя?

Материалы и методы. Исследование включало следующие основные этапы.

Этап 1 — подготовка образцов зубной эмали. В качестве подложки использовали сегменты эмали постоянных зубов человека без видимых кариозных поражений, трещин и реставраций. Подготовку эмалевых образцов, их первичную обработку и формирование исследуемых серий проводили в соответствии с протоколом, ранее подробно описанным для близкой системы осаждения [15] . На этапе отбора зубы подвергали предварительному клиническому осмотру для подтверждения отсутствия кариозных поражений, дефектов, включая эрозии и клиновидные повреждения, а также визуально определяемых изменений структуры эмали.

Сегменты зубной эмали размером 5 × 5 мм² и толщиной приблизительно 2 мм получали с использованием алмазной низкооборотной пилы с водяным охлаждением. После завершения сегментации срезы помещали в герметичные контейнеры с поддержанием постоянной влажности, где они хранились до начала экспериментальных исследований.

Этап 2 — формирование серий A и B. Образец A представлял собой нативную эмаль и использовался в качестве контрольной группы. Для получения образца B поверхность нативной эмали кондиционировали 37 %-ной ортофосфорной кислотой в течение 30 с, после чего осуществляли осаждение слоя nHAp/AA.

Этап 3 — формирование серии C. После кондиционирования поверхности 37 %-ной ортофосфорной кислотой в течение 30 с и последующей щелочной активации последовательно формировали гибридный слой: сначала проводили полимеризацию дофамина в течение 2 ч, затем выполняли осаждение nHAp. Таким образом получали покрытие PDA/nHAp, позволяющее оценить вклад полидофамина при последовательной организации межфазного слоя и минеральной фазы.

Этап 4 — формирование серии D. Образец D получали в одну стадию при совместном протекании электрополевой минерализации и полимеризации дофамина. Покрытие формировали в потенциостатической ячейке с изолированными медными электродами, не контактировавшими с рабочим раствором. Базовый режим одностадийного осаждения включал TRIS-буфер с pH = 8,5, дофамин гидрохлорид — 2 мг/мл, 5 мМ CuSO 4 ·6H 2 O, 20 ммоль H 2 O 2 , суспензию nHAp со средним размером частиц 20–30 нм и конечной концентрацией 1 мг/мл. В качестве аминокислотного компонента использовали аспарагиновую кислоту в концентрации 0,1 мг/мл. Напряжение составляло около 45 В, расстояние между электродами — около 4 мм, продолжительность процесса — 4 ч. Использование системы Cu²⁺/H₂O₂ соответствует опубликованным данным об ускоренном осаждении более однородных плёнок PDA [8] . Такая схема позволяла последовательно оценить вклад предварительной обработки, минеральной фазы, полидофамина и электрического поля. Отдельная контрольная серия без электрического поля или без ускоряющей системы в рамках настоящего исследования не предусматривалась, что учитывали при интерпретации полученных результатов.

Этап 5 — морфологический анализ полученных образцов. Морфологию поверхности исследовали методами сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) на приборе JEOL JSM-6700F (JEOL, Япония) и атомно-силовой микроскопии с использованием установки для ультрамикроскопии станции IMBUIA-nano Бразильской лаборатории синхротронного излучения (LNLS), сочетающей сканирующую оптическую микроскопию ближнего поля (s-SNOM) с ИК-излучением синхротрона. СЭМ применяли для оценки сплошности слоя, характера перекрытия подложки и определения толщины покрытия на поперечных сколах. Оборудование IMBUIA-nano использовали для анализа нанорельефа, профилей поверхности и геометрии отпечатков. Количественную оценку шероховатости выполняли по параметру Ra на сканах 10 × 10 мкм. Выбор указанных методов и параметры их применения соответствовали ранее использованному протоколу исследования гибридных покрытий на эмали [15, 16] .

Этап 6 — оценка механических свойств и статистическая обработка. Поверхностные механические свойства оценивали по микротвёрдости Виккерса на приборе HVS-1000 (TIME Group Inc., Китай) при нагрузке 50 г и времени выдержки 15 с; для каждого образца выполняли по 10 измерений. Поскольку толщина покрытия является конечной, измеряемую величину интерпретировали как поверхностную микротвёрдость композитной системы «покрытие – эмаль», а не как собственную твёрдость изолированного слоя [16] . Для образца D дополнительно проводили АСМ-картирование отпечатков Виккерса и локальный анализ кривых DvZ/DFL.

Такая последовательность этапов позволяла сопоставить влияние предварительной обработки, способа формирования гибридного слоя и режима осаждения на морфологические и механические характеристики системы «покрытие — эмаль».

Статистическую обработку результатов проводили методом однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с последующим множественным попарным сравнением групп по критерию Тьюки; различия считали статистически значимыми при p < 0,05 .

Результаты исследования. В соответствии с целью работы сначала была проанализирована морфология покрытий, сформированных в различных режимах, а затем оценён их поверхностный механический отклик. Сравнение режимов формирования покрытия показало, что тип межфазного взаимодействия существенно влияет на конечную морфологию поверхности (таблица 1). Для образца B, в котором после предобработки осаждали слой nHAp/AA, формировался развитый, но тонкий и слабо интегрированный слой толщиной около 0,4 мкм; по данным морфометрического анализа шероховатость поверхности в этой серии достигала 47,8 ± 5,6 нм, тогда как для нативной эмали она составляла 22,1 ± 3,4 нм. При последовательном введении полидофамина в образце C толщина покрытия возрастала примерно до 0,9 мкм, а параметр R a снижался до 25,4 ± 3,2 нм. Наиболее выраженный эффект зарегистрирован для образца D: одностадийный электрополевой режим обеспечивал более равномерное перекрытие подложки и формирование плотного слоя толщиной 1,0–1,2 мкм с минимальной шероховатостью 18,3 ± 2,6 нм, что может свидетельствовать о более высокой степени морфологической упорядоченности покрытия.

По данным АСМ для образца D характерно наличие упорядоченных наноагрегатов размером около 50–80 нм, формирующих выраженный рельеф и более плотную поверхностную упаковку. Наличие более плотной упаковки и упорядоченных наноагрегатов согласуется с предположением о более организованной межфазной структуре покрытия [13, 18] .

Поверхностная микротвёрдость Виккерса при нагрузке 50 г

Таблица 1

Показатель	A, нативная эмаль	B, nHAp/AA	C, PDA/nHAp	D, (электрополевой)
VHN, M ± SD	280 ± 20	120 ± 10	190 ± 13	310 ± 22

Результаты измерений микротвёрдости показали, что минимальное значение характерно для образца B — около 120 VHN. Для образца C зарегистрировано повышение твёрдости примерно до 190 VHN. Максимальные значения получены для образца D — около 310 VHN, что несколько превышает средний уровень, характерный для нативной эмали, — около 280 VHN. Однофакторный дисперсионный анализ показал статистически значимое влияние типа образца на микротвёрдость ( p < 0,001). По данным апостериорного анализа по критерию Тьюки достоверные различия выявлены между всеми парами образцов, за исключением пары A–D, что свидетельствует об отсутствии статистически значимых различий между образцом D и интактной эмалью в условиях проведённого эксперимента.

Для верификации механических характеристик образца D сначала были проанализированы оптические изображения отпечатков индентора Виккерса на нативной эмали и в электрополевой серии (рис. 1 а, б ). Для более точного определения геометрии отпечатков на текстурированной поверхности их затем дополнительно исследовали методом АСМ-картирования (рис. 1 в, г ). По данным такого анализа для образца D были получены значения порядка 320 VHN при нагрузке 50 г и порядка 290 VHN при нагрузке 10 г. Полученные значения согласуются с результатами оптического микротвердомера и подтверждают, что высокий уровень поверхностной микротвёрдости не является артефактом измерения диагоналей отпечатка на текстурированной поверхности (рис. 1 a–г ).

в)

б)

О 2 4 6 8 10 12 мкм

г)

Механика

д)                                                                           е)

Рис. 1. Исследования механических характеристик нативной эмали и образца D: а, б — оптические изображения отпечатков индентора Виккерса; в, г — АСМ-топография отпечатков; д — типичная силовая кривая локального АСМ-наноиндентиро-вания; е — АСМ-изображение участка поверхности, на котором регистрировали силовой отклик

Для дополнительной оценки локального механического отклика приповерхностного слоя проводили АСМ-наноиндентирование.

При локальном АСМ-наноиндентировании на глубинах менее 50 нм регистрировался отклик приповерхностной PDA-богатой оболочки с модулем Юнга порядка 1 ГПа; типичная силовая кривая приведена на рис. 1 д , а участок поверхности, на котором регистрировали силовой отклик, показан на рис. 1 е .

Обсуждение. Полученные результаты показывают, что более высокий уровень поверхностной микротвёрдости у образца D связан не только с наличием минеральной составляющей, но и с характером межфазной организации гибридного слоя. Это согласуется с уже известными данными о том, что полидофамин способен выполнять функцию адгезионной межфазы и одновременно влиять на ранние стадии минералообразования [8, 10, 12] .

По сравнению с образцом B, у которого после кислотного кондиционирования формировался тонкий и слабо интегрированный слой, а также с образцом C, где улучшение морфологии достигалось преимущественно благодаря последовательному введению PDA, электрополевой режим обеспечивал более плотную упаковку покрытия и более равномерное перекрытие подложки. Вероятно, более организованная межфазная структура и снижение локальной неоднородности покрытия способствовали стабильному распределению механической нагрузки при индентировании. Вместе с тем представленные данные не позволяют однозначно связать повышение твёрдости исключительно с воздействием электрического поля, поскольку химическое ускорение полимеризации также могло вносить заметный вклад.

Принципиально важно, что регистрируемая микротвёрдость характеризует не изолированное покрытие, а композитную систему «покрытие – подложка». Сопоставление толщины слоя порядка 1,0–1,2 мкм с масштабом деформации при нагрузке 50 г показывает, что вклад подложки в измеряемый механический отклик остаётся существенным. Поэтому полученные значения корректнее интерпретировать как поверхностную микротвёрдость системы в целом. В этом смысле данные индентирования по Виккерсу и АСМ-наноиндентирования являются взаимодополняющими: первая методика отражает интегральный ответ гибридного слоя и подложки, тогда как вторая характеризует локальные свойства приповерхностной PDA-богатой оболочки [16] .

Полученные данные подтверждают, что сочетание органической межфазы и минерального компонента может играть важную роль в формировании механически стабильных эмалеподобных покрытий. Результаты согласуются с современными подходами, согласно которым наиболее перспективные биомиметические материалы для твёрдых тканей сочетают управляемую органическую межфазу и минеральный компонент [2, 17, 18] . В этом контексте одностадийная схема с изолированными электродами представляет интерес не только как вариант реминерализации, но и как инженерная стратегия ускоренного формирования организованного поверхностного слоя. Ограничением работы остаётся отсутствие специальной контрольной серии, позволяющей полностью разделить вклад электрического поля и химического ускорителя полимеризации, что не позволяет полностью разделить вклад электрического поля и химического ускорителя в наблюдаемые изменения морфологии и механических характеристик покрытия. Дальнейшие исследования должны включать специальные контрольные режимы и оценку долговременной стабильности сформированных покрытий, в том числе с использованием комплекса методов и алгоритмов машинного обучения [19] .

Заключение. Разработан способ одностадийного формирования гибридного nHAp/PDA-покрытия в электрическом поле с использованием изолированных электродов.

Показано, что электрополевой режим обеспечивает формирование более плотного и морфологически организованного слоя по сравнению с последовательными схемами осаждения и сопровождается наибольшими значениями поверхностной микротвёрдости — до 310 VHN при нагрузке 50 г.

Результаты АСМ-анализа отпечатков и локального наномеханического тестирования подтверждают согласованность оценки механического отклика на различных масштабных уровнях.

Полученные данные позволяют рассматривать предложенный подход как перспективный способ ускоренного формирования функциональных органоминеральных покрытий на апатитсодержащих подложках. Дальнейшие исследования целесообразно направить на варьирование параметров электрического поля, контроль толщины слоя и оценку долговременной стабильности покрытия при комбинированном химико-механическом воздействии.