Эндогенные и экзогенные модификаторы активности Na,К-АТФазы

Предположение о прямом влиянии нейромедиаторов на процессы биосинтеза РНК и белков нервных клеток появилось в середине 60-х годов прошлого века. Оно основывалось на допущении возможности поступления этих соединений в нервные клетки, так как известно, что 20–30 % общего количества ацетилхолина (АХ) и норадреналина (НА) в нервной ткани составляет фонд так называемого свободного медиатора, находящегося в цитоплазме, содержание которого изменяется в зависимости от чередования возбуждения и покоя [9].

При изучении вопроса об их влиянии на процессы транскрипции было обнаружено, что АХ и НА в низких концентрациях (с максимумом при 10 ^–7 –10 ^–5 М) изменяют включение предшественников в РНК клеточных ядер [9]. Однако для подтверждения вывода о прямом воздействии медиаторов на экспрессию генов нервных клеток необходимо было детальное исследование синтеза продуктов индивидуальных генов. В качестве такого обьекта нами был выбран фермент Na,K-АТФаза.

Na,K-ATФаза – интегральный белок, встроенный в цитоплазматическую мембрану и обеспечивающий асимметричное распределение ионов Na ⁺ и K ⁺ между клеткой и внеклеточной средой, играет исключительно важную роль в поддержа-

нии процессов возбудимости и водно-солевого обмена в организме животных и человека. Поэтому не удивительно, что большое количество публикаций посвящено изучению механизмов регуляции функционирования этого фермента.

Особенное внимание в последнее время уделяется поиску и выделению эндогенных (природных) и экзогенных (искусственного происхождения) модификаторов активности Na,K-ATФазы, которые могут оказывать на нее как прямое, так и опосредованное воздействие. Решение этой проблемы имеет не только научное, но и практическое значение. В частности, изменение концентрации таких веществ в организме человека, как полагают, связано с развитием и течением гипертонии, сердечной недостаточности, некоторых форм рака и многих других заболеваний [27].

Имевшиеся до наших работ литературные данные [1] не давали основания для достаточно обоснованного заключения о возможности регуляции этими нейромедиаторами АТФазы in situ, так как, во-первых, были противоречивы, а во-вторых, действующие концентрации слишком высоки – 10–2–10–3 М [9]. Очевидно, что наблюдаемое in vitro обычно небольшое изменение активности фермента было обусловлено сдвигом ионных или буферных свойств среды при добавлении нейромедиатора, поскольку в таком же диапазоне изменялась активность энзима в зависимости от природы буфера.

В качестве модельной системы, позволяющей выяснить механизмы воздействия на Na,K-АТФа-зу ацетилхолина, норадреналина и ксенобиотиков, мы выбрали гомогенат мозга крыс, в котором имеются все вещества и органеллы нервных клеток, необходимые для биосинтетических процессов.

Проведенные нами исследования [12] показали, что регуляторное влияние АХ на уровень активности Na,K-ATФазы в гомогенате мозга крыс заключается в индукции синтеза низкомолекулярного фактора-активатора при одновременном снижении синтеза самого фермента.

Однако в опытах in vivo нами было обнаружено, что внутрибрюшинное введение крысам эзерина в нетоксических дозах (0,2 и 0,4 мг/кг), но вызывающих многократное увеличение содержания АХ в мозге [26], оказывает действие, противоположное тому, которое АХ индуцирует в гомогенате: снижение Na,K-ATФазной активности недиализованных микросом и существенное увеличение активности диализованных.

Оказалось, что в этом случае добавление к интактным микросомам лиофилизированного материала, прошедшего через мембрану при диализе микросомно-цитоплазматической фракции, выделенной из мозга животных, получавших эзерин, вызывает снижение их Na,K-ATФазной активности, то есть при воздействии эзерина in vivo имеет место образование фактора-ингибитора и активация синтеза самого фермента.

Свидетельством того, что при воздействии эзерина происходит увеличение количества молекул фермента в мембранах, служит факт прироста числа центров связывания ³ H-уабаина микросомами (рис. 1а). Обнаружено, что ³ H-уабаин имеет два типа центров связывания в мембране с различным сродством (что соответствует лите-

а

Рис. 1. Связывание 3H-уабаина (в координатах Скэтчар-да) диализованными микросомами: (а) мозга контрольных животных (1) и животных, получавших эзерин (2), (б) контрольного гомогената (1) и гомогената, преинку-бированного с НА в концентрации 10–4 М (2). По оси абсцисс – связанный уабаин (а) в нМ∙10–2, (б) в нМ∙10–3, по оси ординат – отношение связанного уабаина к свободному (а) ∙10–3 , (б) ∙10–4

ратурным данным [19], [23]), причем количество тех и других увеличивается после воздействия эзерина.

Различия в действии эзерина in vivo и in vitro (в концентрациях, полностью подавляющих активность холинэстераз, его влияние в гомогенате подобно АХ) дают основание предположить, что при нарушении целостности мозга из процессов регуляции уровня активности Na,K-ATФазы исключаются какие-то звенья. Одним из них может быть нарушение межклеточных взаимодействий, например исчезновение влияния на холиноцеп-тивные клетки вставочных нейронов, высвобождающих тормозные медиаторы (норадреналин, дофамин), оказывающих противоположное АХ действие на синтетические процессы [10], [11].

С целью проверить данное предположение мы изучили влияние преинкубации гомогената мозга крыс с норадреналином (НА) на активность Na,K-ATФазы микросом [2], [3] и обнаружили, что при этом происходит снижение активности фермента (табл. 1).

Таблица 1

Влияние преинкубации гомогената мозга и микросомно-цитоплазматической фракции с НА на активность Na,K-АТФазы микросом

Преинку-бированная клеточная фракция	Добавленный агент и его концентрация	Условия обработки клеточной фракции	Активность фермента, % от контроля
Гомогенат	НА 10–6 М	Без диализа	93 ± 4 (4)
	НА 10–5 М		86 ± 7 (13)*
	НА 10–4 М		81 ± 6 (15)**
	НА 10–3 М		95 ± 4 (10)
	НА 10–4 М	Диализ	132 ± 10 (9)**
	НА 10–4 М + актиномицин D (50 мкг/мл)	Без диализа	128 ± 9 (6)*
	НА 10–4 М + актиномицин D (50 мкг/мл)	Диализ	127 ± 10 (9)*
	НА 10–4 М + рибонуклеаза (100 мкг/мл)	Без диализа	102 ± 8 (9)
	НА 10–4 М + рибонуклеаза (100 мкг/мл)	Диализ	98 ± 8 (10)
Микросомно-цитоплазматическая фракция	НА 10–4 М	Без диализа	126 ± 7 (9)*

Примечание. * – Р <  0,05; ** – Р <  0,01; в скобках – число опытов.

Эффект зависит от концентрации НА, и максимум угнетения наблюдается при концентрации 10–4 М. После диализа микросомно-цитоплазматической фракции, полученной из преинкубиро-ванного с норадреналином гомогената, изолированные микросомы обладают более высокой по сравнению с контролем Na,K-АТФазной активностью. Этот факт можно интерпретировать в том смысле, что при преинкубации гомогената с НА имеет место образование диализуемого ин- гибитора Na,K-АТФазы; сам же фермент при этом претерпевает либо активацию, либо количество его в мембранах увеличивается. Справедливость настоящего предположения подтверждается тем, что: а) диализуемый материал при добавлении к интактным микросомам ингибирует их Na,K-АТФазную активность (на 30 %), б) преинкубация гомогената с НА на фоне ингибитора транскрипции актиномицина D вызывает увеличение активности фермента как у недиализованных, так и диализованных микросом (на 20–25 %) (см. табл. 1). Таким образом актиномицин D полностью препятствует появлению фактора-ингибитора Na,K-АТФазы и не затрагивает активирующее действие НА на фермент. Ингибитор же трансляции (рибонуклеаза) полностью снимает влияние норадреналина на активность Na,K-АТ-Фазы как недиализованных, так и диализованных микросом.

Полученные нами экспериментальные результаты позволяют предполагать существование следующих путей воздействия норадреналина на уровень активности Na,K-АТФазы: ускорение синтеза фермента на уровне трансляции и одновременная индукция биосинтеза низкомолекулярного фактора-ингибитора с первичным эффектом норадреналина на уровне транскрипции.

Эффект норадреналина при преинкубации недиализованной микросомно-цитоплазматической фракции является подтверждением справедливости предлагаемой интерпретации. В этом случае наблюдалась активация фермента, то есть при удалении ядер из гомогената НА не индуцирует появление фактора-ингибитора, но сохраняется его активирующий эффект на Na,K-АТФазу.

Свидетельством того, что при воздействии НА происходит увеличение количества молекул Na,K-АТФазы в мембранах, служит факт прироста числа центров связывания ³ H-уабаина микросомами (рис. 1б). После преинкубации гомогената с НА (как и в опытах с эзерином in vivo ) увеличивается количество центров связывания обоих типов.

Полученные результаты дают основание предполагать, что в нервных клетках существует система норадреналиновой регуляции уровня Na,K-ATФазной активности мембран, состоящая в активации синтеза фермента на уровне трансляции и одновременной индукции синтеза низкомолекулярного ингибитора его каталитической активности на уровне транскрипции.

Таким образом, нами показано, что in vitro и in vivo существует сложная система медиаторной регуляции уровня Na,K-АТФазной активности нервных клеток, основные черты которой можно представить следующим образом: при активации синтеза энзима параллельно синтезируется фактор-ингибитор, и наоборот – при угнетении синтеза Na,K-АТФазы образуется фактор-активатор. Очевидно, что эти разнонаправленные процессы являются звеньями единой саморегулирующейся системы поддержания активности фермента на оптимальном функционально обусловленном уровне.

С целью сравнить влияние нейромедиаторов на активность фермента нейрональных и других типов клеток мы провели опыты с гомогенатом печени крыс (табл. 2).

Как и ожидалось, в первом приближении биосинтетические процессы в печени и мозге довольно похожи. Например, преинкубация гомогената с АХ в обоих случаях индуцирует синтез низкомолекулярного диализуемого активатора(ов) Na,K-АТФазы и ингибирует процесс синтеза самого фермента. Внутрибрюшинное же введение эзерина крысам вызывает снижение активности энзима. Однако анализ данных табл. 2 позволяет сделать вывод, что при использовании печени эффект выражен более резко, чем для мозга: эзерин in vivo приводит к гораздо более сильному ингибированию (на 70 %), а АХ – к значительно ярче выраженной активации (на 42 %) фермента и несколько сильнее (на 13 %) подавляет синтез молекул Na,K-АТФазы.

Следует отметить, что данные факты не противоречат литературным данным. В кровь (вследствие их синаптической «утечки» при проведении нервного импульса) поступают АХ, НА и другие нейромедиаторы, которые в дальнейшем могут попадать в клетки тканей со слабо выраженной или отсутствующей медиацией соответствующего типа [9].

Согласно данным работы [13], действие АХ на активность ацетилхолинэстеразы микросом мозга и печени также идентично. Однако бесклеточная система печени более чувствительна к АХ, чем система мозга (хотя максимальный эффект и РНКаз гомогената печени и мозга крыс

Влияние эзерина на активность

Таблица 2 in vivo и НА и АХ in vitro Na,K-АТФазы микросом

Условия опыта	Обьект исследования
	Печень		Мозг
	Без диализа	Диализ	Без диализа	Диализ
Na,K-АТФазная активность
Эзерин (0,2 мг/кг)	20 ± 8 (6)**	–	90 ± 3 (14)*	139 ± 6 (9)**
НА (10–4 М) гомогенат	–	–	95 ± 4 (10)	132 ± 10 (9)**
АХ (10–4М) гомогенат	172 ± 21 (6)**	78 ± 9 (9)*	130 ± 7 (11)***	91 ± 4 (9)*
РНКазная активность
Эзерин (0,2 мг/кг)	83 ± 4 (10)**	–	77 ± 3 (8)***	–
Эзерин (0,4 мг/кг)	85 ± 6 (7)*	–	87 ± 4 (7)**	–

Примечание. * - Р <  0,05; ** - Р <  0,01; *** - Р <  0,001; в скобках – число опытов.

наблюдался при одной и той же концентрации АХ – 10 ^–5 М). Этот факт имеет свой биологический смысл, учитывая, что содержание АХ в крови ниже, чем в нервной ткани.

Обратимый ингибитор холинэстераз эзерин в нетоксичной дозе, повышающей содержание АХ в крови, существенно снижает РНКазную активность гомогената как печени, так и мозга крыс (этот эффект подобен его влиянию на Na,K-АТФазу, табл. 2), но увеличивает [13] активность АХЭ микросом печени.

Нам представлялись закономерными постановка и решение вопроса о том, универсально ли действие обнаруженных низкомолекулярных факторов – модификаторов активности Na,K-АТФазы, или же они воздействуют на фермент только тех клеток, в которых сами вырабатываются, то есть не существуют ли для каждого типа клеток особые соединения – регуляторы. С этой целью материал, прошедший через мембраны при диализе микросомно-цитоплазматической фракции, полученной после преинкубации гомогената печени с АХ (10 ^–4 М), инкубировали с микросомами мозга. Наблюдавшееся в этих опытах существенное увеличение активности Na,K-АТФазы (150 %, n = 52, p <  0,0001), по-ви-димому, свидетельствует о том, что фактор – активатор фермента не обладает строгой тканевой специфичностью.

Поскольку в организме животных и человека существуют различные типы низкомолекулярных модификаторов активности Na,K-АТФазы, мы попытались выделить соединения, обладающие подобными свойствами в индивидуальном состоянии.

На первом этапе очистки микросомно-цитоплазматическую фракцию, полученную из гомогената головного мозга крупного рогатого скота, диализовали против 10 объемов дистиллированной воды. Диализат концентрировали в вакууме и разделяли на колонке, заполненной силикагелем. Содержимое полученных фракций анализировали методом ТСХ на силуфоле (рис. 2а) и проверяли их способность изменять активность Na,K-АТФазы.

Рис. 2. Анализ методом ТСХ на силуфолах фракций, полученных при разделении колоночной хроматографией на силикагеле диализата микросомно-цитоплазматической (а) и элюата фракции 1 (б) и препаративное разделение на си-луфолах соединений фракции 1.1 (в). Проявление: нингидрином (а, б), «боковое» парами йода (в). Подвижная фаза: вода (а), хлороформ–этанол–вода = 5 : 13 : 5 (б), хлороформ– этанол–вода = 13 : 20 : 5 (в)

Материал первой фракции, полученный с использованием в качестве элюента дистиллированной воды и обладающий способностью ингибировать фермент (М = 66 %, n = 13, p <  0,01), вновь фракционировали на силикагеле, используя в качестве подвижной фазы систему растворителей хлороформ – этанол – вода (5 : 13 : 5) (рис. 2б).

Далее содержимое фракции 1.1 (М = 68 %, n = 8, p <  0,005), не проявляемое нингидрином, разделяли методом ТСХ на силуфоле с использованием системы растворителей хлороформ – этанол – вода (13 : 20 : 5) (рис. 2в).

После «бокового» проявления парами йода вещества с пластинки элюировали водой и вновь анализировали их способность модифицировать активность Na,K-АТФазы (табл. 3).

Таблица 3

Влияние соединений, содержащихся в элюате с силуфола (см. рис. 2), на активность Na,K-АТФазы микросом мозга крупного рогатого скота

Фракции	Эффект в % к контролю	Число опытов	Коэф. Стьюдента	Уровень значимости
1.1.1	100 ± 11	5	0,42
1.1.2	63 ± 10	7	2,48	< 0,05
1.1.3	75 ± 5	9	5,77	< 0,001
1.1.4	74 ± 7	7	4,13	< 0,005

Согласно данным табл. 3, фракция 1.1 содержит или несколько веществ, способных ингибировать фермент, или одно соединение, существующее в нескольких формах [14].

Далее мы исследовали некоторые свойства компонентов фракции 1.1.3 (самое сильное проявление парами йода). Как было показано методом масс-спектрометрии, эта фракция включает хлористый аммоний, который может иметь как эндогенное, так и экзогенное (в химических лабораториях в воздухе всегда содержатся HCl и аммиак, которые при концентрировании больших объемов растворов загрязняют выделяемые соединения) происхождение. Использование цветной реакции между хлористым аммонием и реактивом Несслера [17] позволило количественно оценить содержание этой соли (70 %).

В ИК-спектре фракции 1.1.3 (рис. 3) наблюдаются следующие полосы поглощения (см ^–1 ): 3600–2800 (шир., с.), 1615 (с.), 1400 (с.), 1110 (сл.), 1040 (сл.). Их положение соответствует наличию С-Н, О-Н, С-N и N-H (в аммонийной форме) связей.

При кратковременном нагревании компонентов данной фракции при 180 °С вместо одной широкой полосы при 3140 см ^–1 появляются две (3430 и 3135 см ^–1 ), что, возможно, вызвано разложением менее устойчивого, чем хлорид аммония, органического соединения, содержащего в своем составе аммонийные группы.

В спектре ¹ Н ЯМР ингибитора в D₂O (рис. 4) присутствуют дублет при 1,38 м. д. и мультиплет

Рис. 3. ИК-спектры в KBr фракции 1.1.3 (а), NH4Cl (б) и фракции 1.1.3, прогретой 20 секунд при 180 °С (в)

в области 3,31–3,82 м. д. (за счет электроотрицательных атомов, например азота и кислорода, дезэкранирующих протоны). Наличие широкого и мощного пика в области 4,0–5,5 м. д. обусловлено примесью HOD и H2O в дейтерированном растворителе. Этот факт не позволил сделать однозначный вывод о наличии или отсутствии гидроксильных групп в исследуемом образце.

Спектр ¹³ С ЯМР фракции 1.1.3 в D 2 O (рис. 5) содержит четыре сигнала при 20,66, 63,11, 69,02 и 72,68 м. д. (четыре типа атомов углерода); слабая интенсивность поглощения в ИК-спектре в области, соответствующей валентным колебаниям С-Н связей (рис. 5), свидетельствует об их малом количестве. Регистрация спектра ¹³ С ЯМР в режиме dept 135 указывает на отсутствие четвертичных атомов углерода и позволяет сигнал при 63,11 м. д. приписать СН 2 группе, а остальные сигналы – СН и СН₃ группам.

Данные спектроскопии ¹³ С ЯМР однозначно указывают на то, что молекула ингибитора не содержит двойные связи и ароматические кольца ввиду отсутствия сигналов в соответствующих им слабых полях, но не исключают наличия гидроксильных, простых эфирных или аминогрупп, а также дизамещенной тройной связи. Однако поскольку все известные к настоящему времени природные ацетиленовые соединения имеют растительное происхождение, а мы выделили ин-

Рис. 4. Спектр протонного магнитного резонанса фракции 1.1.3 в D 2 O

гибитор из мозга животных, присутствие в нем тройной связи кажется маловероятным. Кроме того, нагревание водного раствора ингибитоpа на кипящей водяной бане с 6N HCl в течение 30 мин. не приводит к изменениям в его хроматографическом поведении в тонком слое (ТСХ). Это указывает на отсутствие в молекуле фрагментов, способных к гидролизу или реакциям электрофильного присоединения (для ацетиленовых соединений характерны реакции АЕ с галогенводородными кислотами).

Методом гель-хроматографии на молселекте Г-10 нам удалось освободиться от хлорида аммония во фракции 1.1.3 и оценить молекулярную массу ингибитора (около 200 Да). В качестве реперных веществ использовали глутатион, углекислый натрий и глицин.

После обработки 4 кг мозга крупного рогатого скота нами было выделено около 2 мг белого твердого вещества, содержащего активное начало фракции 1.1.3 и обладающего выраженной способностью ингибировать Na,K-АТФазу. Индивидуальность данного соединения доказана методами ТСХ, ВЭЖХ и гель-хроматографии. Оно хорошо растворимо в воде и метаноле и очень плохо в хлороформе.

Нами также были зарегистрированы масс-спектры самого ингибитора и его силилиро-ванного аналога (рис. 6), в которых не удалось идентифицировать пики молекулярных ионов. Интерпретация этих спектров согласуется с приведенными выше данными, а соотношение количеств изотопов кремния ²⁸ Si, ²⁹ Si и ³⁰ Si указывает на то, что силилированию в молекуле исследуемого соединения, по-видимому, подверглись три функциональные группы.

Суммируя имеющиеся данные, мы склонны считать, что выделенный ингибитор содержит

Рис. 5. Спектры 13С ЯМР в обычных условиях (слева) и в режиме dept 135

Рис. 6. Хроматограмма силилированного ингибитора (а) и его масс-спектр (б)

как минимум четыре атома углерода, тpи амино- (в аммонийной форме) и гидроксильн(ую)ые группы. Возможно, он является ациклическим аминоспиртом или его производным, содержащим простую эфирную связь.

К настоящему времени известны различные эндогенные ингибиторы Nа,К-АТФазы – катионы Ca ²⁺ [16], [18], ванадат-ион [20], нейромедиаторы (ацетилхолин, норадреналин и др. [1], [3], [9], [12], [18]), гистидил-пролилдикетопиперазин [20] и «уабаинподобные» гликозиды [25]. В работе Елаева и Байгильдиной [14] сообщалось об эндогенном ингибиторе с молекулярной массой около 190 Да, который, по мнению авторов, является амидом, содержащим морфолиновую структуру.

Анализ полученных нами данных позволяет сделать вывод о том, что выделенный нами из мозга крупного рогатого скота ингибитор [4] Nа,К-АТФазы не имеет аналогов в литературе. Выяснение в деталях его структурной формулы, а также механизмов биосинтеза и взаимодействия с Na,K-АТФазой является предметом дальнейших наших исследований.

Кроме того, мы исследовали способность влиять на активность Nа,К-АТФазы некоторых других кислород- и азотсодержащих экзогенных соединений.

Гетероароматические N-оксиды показывают широкий спектр биологической активности и образуются в организме животных и человека при инактивации гетероциклических соединений. Однако их влияние на Na,K-АТФазу практически не исследовалось. Мы нашли лишь несколько работ, в которых они используются как лекарственные препараты [1] и при изучении ЭПР-спек-тров (например, 5,5-диметил-1-пирролин N-оксид [25]), а N-оксид 2-гептил-4-гидроксихинолина применяют как ингибитор цитохромных систем [21], [22].

Ввиду того, что нами в последние годы синтезировано большое количество гетероароматичес-ких N-оксидов (I–V), мы проверили способность соединений этого класса в физиологических концентрациях (10 ^–4 –10 ^–10 М) изменять in vitro активность Na,K-АТФазы мозга крупного рогатого скота.

1ф.в-ж,с-у.х Пб-г,е,ж,к-Р.у-м III IVs.n                    V              VI

Y =H X = H(a), 2-Ме(б), 4-Ме(в), 4-MeO(r), 4-Вг(д). 4-SH(e), 4-МО2(ж). Э-МСОД, 9-С1(и), 4-ЗАд(к). 4-Мз(л). 4-(3-NO2Ph), 4-SPh(2.4-NO2XH). 4-SCH,CH2OH(O), 4-CH=CHPh(4-OMe)(T), 4-CH=CHPh(2.4-OMe(y). 2-CH=CHPh(4-NMe2)(0). 4-CH=CHPh(4-NNMe2Mx). 2-CH=NPh(4-NMe2X4)

Y = Me. X = NO^m)

N-оксиды 4-метокси- и 4-бромпиридина, 2-ме-тил, 4-метокси-, 4-меркапто-, 3-нитрофенокси, 4-стирил и 2-стирилхинолина, моно-N-оксида хиноксалина и соединение IV в концентрации 10 ^–4 М не изменяли (n = 10) активность, и поэтому для них при более низких концентрациях исследования не проводили. Данные для других соединений представлены в табл. 4.

Полученные результаты [5] показали, что 16 из них являются ингибиторами (на 67–20 %) Na,K-АТФазы даже при концентрациях 10 ^–8 М, что сопоставимо или превышает эффективность строфантинов К и G. Активность 15 ингибиторов (за исключением № 9) сохраняется постоянной в диапазоне концентраций 10 ^–4 –10 ^–8 М и только при дальнейшем уменьшении их концентрации претерпевает изменения. По-видимому, этот феномен можно объяснить образованием прочных комплексов N-оксидов с Na,K-АТФазой. Так, если предположить существование таких аддуктов состава 1 : 1, то до тех пор, пока число молекул N-оксида будет превышать число центров связывания фермента, его ингибирование не должно изменяться. Это мы и наблюдаем в указанном диапазоне концентраций. Как только число молекул N-оксида станет меньше числа молекул фермента, не связанные с ингибитором молекулы Na,K-АТФазы будут повышать общую активность энзима, и тем в большей степени, чем больше будет соотношение фермент / N-оксид. В этом случае даже двукратное изменение указанного соотношения должно приводить к заметным изменениям активности фермента. Например, для соединений № 5–7, 14, 20 при переходе от 10 ^–8 к 10 ^–9 М ингибиторный эффект пропадает полностью и только для № 14 активен даже при 10 ^–10 М. Активирующее действие соединения № 9 при 10 ^–4 М, по-ви-димому, является неспецифическим и может быть обусловлено значительной концентрацией ионов Ag ⁺ .

Особо следует отметить резко выраженный (180–190 %) активирующий эффект соединения

Таблица 4

Влияние гетероароматических N-оксидов на активность Na,K-АТФазы микросом

	Активность фермента, % от контроля
№         Х	Концентрация N-оксида
	10–4 М            10–6 М            10–8 М          10–9 М         10–10 М

PyO

1	4-Me	78 ± 1 (10)***	81 ± 2 (10)***	83 ± 1 (10)***
2	4-NO 2	91 ± 2 (9)***
3	4-[CH=CHC 6 H 5 (4-OCH 3 )]	63 ± 2 (10)***	83 ± 1 (10)***	80 ± 1 (10)***
4	2-[CH=CHC 6 H 5 (4-OCH 3 )]	96 ± 1 (10)**
5	4-[CH=CHC 6 H 3 (2,4-OCH 3 )]	34 ± 3 (9)***	34 ± 1 (10)***	37 ± 1 (10)***	97 ± 2 (10)	97 ± 4 (15)
6	4-[CH=CHC 6 H 4 (4-N(CH3) 2 ]	22 ± 2 (20)***	29 ± 1 (9)***	37 ± 1 (10)***	97 ± 2 (10)	102 ± 2 (10)

QO

7	H	39 ± 3 (10)***	22 ± 2 (10)***	27 ± 3 (10)***	99 ± 2 (10)	93 ± 5 (10)
8	4-Me	104 ± 1 (10)**
9	4-SAg	170 ± 5 (9)***	76 ± 3 (10)***	74 ± 3 (9)***
10	4-N 3	64 ± 1 (10)***	72 ± 1 (10)***	65 ± 9 (7)**
11	4-Clа	68	72	77		76
12	4-Brа	75	77	85		82
13	4-NO2	33 ± 2 (9)***	32 ± 1 (10)***	33 ± 1 (10)***		101 ± 4 (10)
14	2-Me-4NO 2	41 ± 1 (10)***	43 ± 1 (10)***	46 ± 1 (10)***	94 ± 2 (10)*	90 ± 4 (15)*
15	4-SC 6 H 4 (2,4-NO 2 )	62 ± 3 (10)***	72 ± 1 (10)***	73 ± 1 (9)***
16	4 –SCH 2 CH 2 OH	91 ± 2 (10)**
17	4- [CH=CHC 6 H 3 (2,4-OCH 3 )]	56 ± 4 (10)***	188 ± 2 (10)***	179 ± 1 (10)***	108 ± 2 (10)**	100 ± 2 (10)
18	4-[CH=CHC 6 H 4 (4- (CH 3 ) 2 ]	47 ± 1 (10)***	44 ± 1 (10)***	50 ± 1 (10)***		96 ± 4 (10)
19	2-[CH=CHC 6 H 4 (4-N(CH 3 ) 2 ]	59 ± 2 (10)***	58 ± 2 (10)***	69 ± 3 (10)***		104 ± 3 (10)
20	2-[CH=NC 6 H 4 (4-N(CH 3 ) 2 ]	56 ± 2 (10)***	60 ± 1 (10)***	57 ± 1 (10)***	98 ± 2 (10)	90 ± 2 (15)**

AcrO

21	9-NO2	87 ± 3 (10)**	104 ± 4 (10)	98 (10)		111 ± 5 (15)*
22	9-Cl	108 ± 4 (15)*	99 ± 4 (10)	114 ± 5 (15)*		97 ± 2 (10)

Другие соединения

23	Фуроксан IV	66 ± 1 (10)***	65 ± 1 (10)***	64 ± 1 (10)***		97 ± 3 (10)
24	V	28 ± 1 (10)***	29 ± 1 (10)***	31 ± 1 (10)***		99 ± 2 (9)
25	Фталимид	39 ± 3 (10)***	22 ± 2 (10)***	27 ± 3 (10)***	99 ± 2 (10)	93 ± 5 (10)

Примечание.^а Данные работы [15], n = 10, Р <  0,05. * - Р <  0,05; ** - Р <  0,01; *** - Р <  0,001; в скобках - число опытов.

№ 17 (№ 22 – менее активен), так как в настоящее время неизвестны вещества, обладающие подобным действием на фермент. Ввиду того что данное воздействие вызывается очень низкими его концентрациями (10 ^–6 –10 ^–8 М), можно предположить, что в составе Na,K-АТФазы имеется, по крайней мере, один особый центр, ответственный за взаимодействие с соединениями, активирующими фермент. Таким образом, следует ожидать открытия и других эндогенных активаторов данного энзима. Ингибирующая способность соединения № 17 при более высокой концентрации (на 42 % при 10 ^–4 М), по-видимому, является неспецифической.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Выделение эндогенного ингибитора Nа,К-АТФазы

2 кг мозга, полученного на Петрозаводском мясокомбинате [4] в день забоя животных, гомогенизировали в дистиллированной воде (из расчета 1 мл на мозг). Гомогенат центрифугировали 15 мин. при

12 000 g, супернатант диализовали против 10 объемов дистиллированной воды в течение 12 ч. при +4 ° C. Полученный диализат концентрировали в вакууме при 30-35 ° C до объема 10 мл и использовали для дальнейших исследований. Материал, не прошедший через мембраны, центрифугировали 60 мин. при 30 000 g. Осадок микросом суспензировали в 0,05 М трис-HCl (pH 7,55) и хранили при -20 ° C (в течение 1 месяца активность Nа,К-АТФазы оставалась почти неизменной). Определение способности выделенных соединений модифицировать активность Nа,К-АТФа-зы осуществляли, как описано ранее [12]. Выделение ингибитора из диализата состояло из следующих этапов.

• 1.    В колонку диаметром 20 мм, содержащую 20 г силикагеля L 100/250 мкм фирмы Chemapol, вносили 1 мл диализата от 200 г мозга и элюировали водой, собирая аликвоты объемом 5 мл. Содержимое фракций анализировали методом ТСХ на си-луфоле (подвижная фаза – вода, проявление 0,1 % спиртовым раствором нингидрина, рис. 1а).

• 2.    Материал первой фракции концентрировали до обьема 1 мл, наносили на 20 г силикагеля L 40/100, помещенного в колонку диаметром 20 мм, и элюировали системой растворителей хлороформ – этанол – вода (5 : 13 : 5). Анализ содержимого фракций осуществляли методом ТСХ на силуфо-ле (подвижная фаза хлороформ – этанол – вода (5 : 13 : 5), проявление 0,1 % спиртовым раствором нингидрина, рис. 1б). Для дальнейшей работы использовали непроявляемую нингидрином фракцию 1.1.

• 3.    Содержимое фракции 1.1 высушивали в вакууме. Сухой остаток растворяли в 0,5 мл H 2 O и разделяли методом ТСХ на силуфолах (нанесение полоской, подвижная фаза хлороформ – этанол – вода (13 : 20 : 5), рис. 1в). После «бокового» проявления парами йода вещества с пластинки элюировали водой и анализировали их способность модифицировать активность Nа,К-АТФазы.

• 4.    Содержимое фракции 1.1.3 высушивали в вакууме, сухой остаток растворяли в 1 мл H 2 O и вносили в колонку (2 × 75 см) с гелем молселект Г-10 (тонкий), уравновешенный дистиллированной водой. Элюирование проводили со скоростью 15 мл/ч, аликвоты обьемом 2 мл отбирали с помощью коллектора фракций.

Доказательство индивидуальности выделенных веществ

Об индивидуальности выделенного нами ингибитора Nа,К-АТФазы свидетельствует наличие лишь одного регистрируемого компонента при использовании описанных ниже хроматографических методов разделения.

• 1.    ТСХ на силуфолах и на силикагеле L 5/40 (фирмы Chemapol) с 13 % гипса. Использовали следующие системы растворителей: хлороформ – этанол – вода (13 : 20 : 5, 5 : 13 : 5), бензол – этанол (2 : 1), бутанол – уксусная кислота – вода (4 : 1 : 1). Проявление пластинок во всех случаях осуществляли парами йода.

• 2.    ВЭЖХ (насос HPP-5001, УФ-детектор LCD 2040, самописец TZ 4620, фирмы Laboratorni pristroje, Praha, A = 235 нм). Хроматографирование осуществляли с использованием колонок Separon C 18 , CN, NH 2 и следующих систем растворителей: ацетонитрил – вода (84 : 16), вода, хлороформ – этанол – вода (13 : 20 : 5), хлороформ – этанол (10 : 1).

• 3.    Газожидкостная хроматография:

• а)    Силилирование.

Смесь 0,2 мг сухого остатка (фракции 1.1.3), 1 мкл пиридина и 100 мкл N-метил-N-(триметилсилил) трифторацетамида (MSTFA) нагревали при 60 ° C в течение 20 мин.

• б)    Условия ГЖХ-анализа.

Газовый хроматограф HP 5890 фирмы Hewlett-Packard (USA), оснащенный пламенно-ионизационным детектором и кварцевой капиллярной колонкой 12,5 м × 0,2 мм (внутренний диаметр), неподвижная фаза HP-1 с толщиной слоя 0,33 мкм.

Расход газа-носителя (гелий) – 1,5 см³/мин, водорода и воздуха к детектору – 25 и 250 см³/мин соответственно. Температуру колонки изменяли от 40 до 280 ° C со скоростью 10 °C/мин. Температура испарителя и детектора - 250 и 300 ° C соответственно. Объем вводимых проб составлял 0,5–1,0 мкл в режиме разделения потока 1 : 10. Регистрацию результатов проводили с использованием интегратора HP 3396A фирмы Hewlett-Packard (USA) .

Исследование структуры ингибитора Na,K-АТФазы

ИК-спектр соединения, представленного фракцией 1.1.3, снимали в KBr на приборе Specord M 80, ПМР-и ¹³С ЯМР-спектры в D 2 O – на приборе Bruker AM (500 Мгц), масс-спектр ингибитора – на приборе МХ 1321 (70 eV), а его силилированного производного – на хромато-масс-спектрометре GC/MS 5988A (70 eV) фирмы Hewlett-Packard (кварцевая капиллярная колонка 25 м х 0,32 мм, толщина пленки неподвижной фазы HP-1–0,52 мкм. Температуру колонки программировали от 40 до 270 ° C со скоростью 4 °C/мин. Остальные условия аналогичны тем, которые описаны в разделе ГЖХ).

Гетероароматические N-оксиды были синтезированы в соответствии с методами, описанными в работах [1], [6], [7], [8]. Их способность in vitro модифицировать активность Na,K-АТФазы была исследована, как описано в работах [1], [2]. Написание данной статьи отчасти вызвано тем, что в работах [8], [15] были использованы экспериментальные данные, касающиеся выделения и характеристики ингибитора Na,K-АТФазы и влияния полученных нами гетеро-ароматических N-оксидов на его активность, без разрешения авторов и без ссылок на соответствующие работы [4], [5].

* Работа выполнена при поддержке Программы стратегического развития ПетрГУ в рамках реализации комплекса мероприятий по развитию научно-исследовательской деятельности на 2012–2016 гг.