Эндогенный SEMA4D в контроле пролиферации и апоптоза Т-лимфоцитов

Sema4D, или CD100, – молекула, принадлежащая IV классу семафоринов [Semaphorin …, 1999]. Подобно другим членам семафоринового семейства, она участвует в процессах аксонального наведения в ходе роста нейронов [Kolodkin, Matthes, Goodman, 1993]. Наряду с этим, Sema4D широко представлен в иммунной системе и играет важную роль в ее функционировании. Он конститутивно экспрессируется на мембране Т-лимфоцитов [Bougeret et al., 1992], а при активации клеток усиливает экспрессию и переходит в растворимую форму за счет протеолитического отщепления, сохраняя при этом функциональную активность [Hérold et al., 1995; Wang et al., 2001; Elhabazi et al., 2001]. В связи с этим, Т-лимфоцит рассматривался традиционно исключительно как источник

Sema4D в иммунной системе, растворимого или мембранного, а мишенями его действия считали клетки, экспрессирующие низкоаффинный сема-фориновый рецептор CD72 [Kumanogoh, Kikutani, 2001; Mizui et al., 2009].

Однако в недавней работе показано [Куклина, Некрасова, Валиева, 2017], что Т-лимфоциты несут на мембране высокоаффинный рецептор для Sema4D, плексин В1, экспрессия которого ранее приписывалась исключительно неиммунным тканям [Takamatsu et al., 2010; Zhang et al., 2013]. Помимо этого, Sema4D может выступать не только как лиганд, но и как рецептор, проводя сигнал в клетку, на которой экспрессирован [Hérold et al., 1995; Zhang et al., 2013]. В связи с этим можно предположить, что Т-лимфоциты являются не только источником, но и мишенью действия

Sema4D. Целью работы было определение роли эндогенного Sema4D в активации Т-лимфоцитов.

Материалы и методы

В работе использовали лейкоциты здоровых доноров. ( n =10). От всех доноров получено информированное согласие на участие в исследовании. Лейкоциты выделяли из гепаринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина (1.077 г/см³) («Pharmacia»). В работе использовали CD3⁺Т-лимфоциты, фракционированные на иммуномаг-нитных частицах с помощью соответствующей системы для выделения (“R&D Systems”). Т-клетки в концентрации 1 × 10⁶ клеток/мл (для оценки пролиферации) или 2 × 10⁶ клеток/мл (для оценки апоптоза) культивировали 72 или 24 ч., соответственно, в среде RPMI 1640 (“Gibco. Thermo Fisher Scientific”) с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (Serva), 1 мМ HEPES (“Sigma-Aldrich”), 300 мг/мл L-глутамина (“Serva”) и 100 мг/мл гентамицина (“Pharmacia”) при 37^оС и 5% СО 2 в условиях поликлональной активации (система для активации на основе моноклональных антител к CD3/CD28, “Invitrogen”).

Изучение роли эндогенного Sema4D в регуляции ранних этапов активации лимфоцитов проводили с учетом не только основного варианта ответа клеток на стимуляцию, пролиферации, но и альтернативного – апоптоза (программированной клеточной гибели). Пролиферативный ответ оценивали по включению в клетки синтетического аналога тимидина, 5-бром-2’-дезоксиуридина (BrdU), с помощью набора для иммуноферментного анализа (Amersham). BrdU добавляли в образцы за 18 ч. до окончания культивирования. Апоптоз Т-лимфоцитов оценивался по экспрессии на мембране фосфатидилсерина (маркер раннего апоптоза) – с помощью соответствующего лиганда, аннексина V, меченого флуоресцеинизотиоцианатом (AnnV*FITC, “R&D Systems”), и по включению в клетку пропидия йодида (PI, маркер позднего апоптоза) флуоресцентного ДНК- интеркалирую-щего красителя (“Sigma-Aldrich”). Оценка проводилась методом проточной цитометрии. Источником эндогенного Sema4D в культуре служили сами Т-лимфоциты [Hérold et al., 1995; Wang et al., 2001; Elhabazi et al., 2001].

Для оценки роли Sema4D в активации лимфоцитов использовали его блокаду анти-Sema4D антителами (10 μg/mL, Santa Cruz Biotech), которые добавляли в культуру за 1 ч. до активации лимфоцитов. Статистическая обработка проводилась с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Исследование показали непосредственное участие Sema4D в пролиферативном ответе Т-лимфоцитов на поликлональную активацию (анти-CD3/CD28): при блокаде Sema4D наблюдалось статистически значимое снижение индекса пролиферации как для CD4, так и для CD8 Т-

Роль Sema4D в пролиферативном ответе Т- лимфоцитов на поликлональную активацию: а) без блокады Sema4D, б) на фоне блокады Sema4D. * - p < 0.05 (в сопоставлении с соответствующим показателем без блокады); заштрихованный столбец – CD4+Т-лимфоциты, незаштрихованный – CD8+Т-лимфоциты

Уровень активационно-индуцированного апоптоза, напротив, возрастал в случае блокады Sema4D, как для CD4+, так и для CD8+Т-лимфоцитов (таблица), указывая на антиапоптоти-ческую активность семафорина.

Роль Sema4D в регуляции апоптоза Т-лимфоцитов

Примечание. * - p < 0.05 (в сопоставлении с соответствующим показателем без блокады).

Эти изменения касались не только экспрессии раннего маркера апоптоза, фосфатидилсерина (рецептора аннексина V), но и содержания Т-лимфоцитов, находящихся в поздней фазе апоптоза (позитивных и по аннексину V, и по PI), Важно отметить, что данные эффекты блокатора Sema4D выявлены в Т-лимфоцитах только в присутствии аутологичных В-клеток, тогда как в монокультуре Т-лимфоцитов уровень апоптоза имел лишь тенденцию к повышению.

По-видимому, для эффективной реализации ан-тиапоптотического действия Sema4D требуется кооперативное взаимодействие Т-лимфоцитов с другими клетками, на которых уровень экспрессии рецепторов для него существенно выше – В-лимфоцитами или дендритными клетками.

Заключение

В целом, полученные результаты показали следующее: 1) Sema4D контролирует пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на активацию, выступая как позитивный регулятор; 2) Sema4D также участвует в регуляции альтернативного пути ответа клеток на стимуляцию – активационно-индуцированного апоптоза, играя негативную роль в этом процессе.

Реципрокный эффект Sema4D в отношении пролиферации и апоптоза Т-лимфоцитов должен усиливать активацию Т-клетки в ответ на антиген. Данный эффект может достигаться при действии как мембран-связанного семафорина, так и растворимого, причем растворимый Sema4D в ходе активации лимфоцита может действовать как аутокринный или паракринный фактор, подобно интерлейкину 2.

Работа поддержана грантом РФФИ № 15-0405694.