Эпигенетические нарушения и нейроэндокринная дифференцировка при раке предстательной железы

Около 5–10 % случаев рака предстательной железы (РПЖ) имеет наследственный анамнез, тогда как подавляющее большинство его случаев являются спорадическими и сопровождаются активацией протоонкогенов в онкогены [1]. Такое подавление супрессорной и усиление онкогенной активности с последующей злокачественной трансформацией рака обусловлено генетическими аберрациями (мутациями), эпигенетическими изменениями, а также изменениями в микроокружении опухоли (МКО) [2, 3].

Эпигенетика – раздел генетики, изучающий наследуемые изменения активности генов во время роста и деления клеток, а под эпигенетическим наследованием подразумевают изменения синтеза белков, вызванных механизмами, не изменяющими последовательность нуклеотидов в ДНК [4]. До сих пор генетические исследования и работы по профилированию первичного РПЖ были сосредоточены на наиболее изученных изменениях этого типа опухоли, например, таких как изменения экспрессионного профиля андрогенных рецепторов (АР), на единичных точечных мутациях ДНК, а также экспрессии мРНК [5, 6]. Однако с ростом масштабного секвенирования генома и комплексных многомерных анализов начала вырисовываться другая картина, где было выявлено, что эпигенетические изменения могут приводить к другим более значимым механизмам трансформации и канцерогенеза РПЖ [7].

Исследования методом полногеномного секвенирования (Whole genome sequencing – WGS) в образцах пациентов выявили многочисленные изменения при первичном и распространенном РПЖ [8–10]. Одним из важнейших шагов в изучении эпигенетических изменений стала возможность доступного одноклеточного РНК-секвенирования (оРНК-сек) [11]. Метод оРНК-сек позволяет не только оценить экспрессионный профиль на уровне отдельных клеток, но и понять, как функционирует каждая клетка и какие функции она выполняет [12]. Иными словами, данный метод помогает понять, какие гены в клетке «включены» и «выключены» в данный момент, тем самым установить, как клетка себя проявит, например, превратится ли в раковую, как будет взаимодействовать с иммунной системой и т.д. Сегодня оРНК-сек активно применяют для разработки препаратов, при изучении болезней и их лечении, а также для того, чтобы понять, как развиваются и функционируют различные живые организмы на уровне их клеток. Одноклеточное РНК-секвенирование может легко иллюстрировать экспрессию различных клеточных популяций, кластеризовать клетки по состоянию или типу, выявлять точечные мутации и т.д. [1, 13]. Поэтому, с одной стороны, идентификация маркерных генов с помощью транскрипционных данных среди отдельных клеток является отличным способом облегчить понимание гетерогенности опухоли для клинической практики [11, 14], а с другой стороны, идентификация типов клеток из ряда гетерогенных клеток является интуитивным способом понимания происхождения развития опухоли [15].

Генетическая информация из ДНК клеток организована в нуклеопротеиновый комплекс, называемый хроматином. Основной хроматиновой единицей является нуклеосома, состоящая из 146 пар оснований ДНК, обернутых вокруг октамера из четырех пар гистоновых белков (H2A, H2B, H3 и H4) [16]. Концевые хвосты гистонов, расположенные периферийно, подвергаются различным ковалентным модификациям [17]. Последовательность этих модификаций называют «гистоновым кодом», и он действует как второй уровень эпигенетической регуляции экспрессии генов, влияющий на структуру хроматина [18]. Метилирование ДНК, модификации гистонов и ремоделирование хроматина являются тесно связанными эпигенетическими механизмами в процессе инициации и прогрессирования РПЖ, а также с временем до развития лекарственной устойчивости [19]. Эпигенетический контроль экспрессии генов часто требует сотрудничества и взаимодействия как метилирования ДНК, так и модификации гистонов. Нарушение любого из этих событий приведет к аберрантной экспрессии генов, что наблюдается почти во всех типах рака человека, в том числе и РПЖ [20]. В свете накопленных доказательств развития механизмов резистентности, эпигенетические изменения приводят к усилению или ослаблению транскрипционной активности и играют важную роль в проонкогенной сигнализации АР [21].

В отличие от последствий генетических аберраций, эпигенетический признак – это наследуемый фенотип, возникающий в результате изменений в хромосоме, но при этом без изменений в последовательности ДНК [22]. По результатам большого количества научных работ было показано, что метилирование ДНК, модификация гистонов и ремоделирование хроматина способствуют инициации и прогрессированию рака и, что наиболее важно, в отличие от генетических изменений, эпигенетические аберрации могут быть обращены вспять под воздействием химического агента. Этот факт делает эпигенетические изменения важным объектом изучения в качестве потенциальных терапевтических мишеней [23].

В данной статье мы рассмотрим современные знания и исследования, касающиеся эпигенетических изменений при РПЖ, таких как метилирование ДНК и модификация гистонов. Также рассмотрим влияние линейной пластичности и нейроэндокринной дифференцировки, обсудим их значение для понимания молекулярной основы РПЖ и для его клинической диагностики и лечения.

Метилирование ДНК при РПЖ

В 1987 г. M.T. Bedford и P.D. van Helden сообщили, что при метастатическом РПЖ метилирование ДНК было значительно снижено, по сравнению с доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ). Это первое исследование, демонстрирующее корреляцию между гипометилированием и метастатическим потенциалом РПЖ [24]. В целом, метилирование ДНК является одним из первых обнаруженных эпигенетических изменений, которое происходит путем добавления метильной группы к 5’-углероду цитозина посредством трех активных ДНК-метилтрансфераз (DNMT): DNMT1, DNMT3a и DNMT3b [21, 25]. Изменения в метилировании ДНК могут происходить путем как гипо-, так и гиперметилирования, что приводит к хромосомной нестабильности и подавлению генов-супрессоров опухоли. Оба этих процесса обусловливают злокачественные новообразования в предстательной железе (ПЖ) [26].

Гены-супрессоры опухолей, подавленные гиперметилированием промотора при РПЖ, участвуют в важных клеточных путях, таких как контроль клеточного цикла, апоптоз, восстановление повреждений ДНК или гормональный ответ. На данный момент было выявлено более 100 таких генов применительно к РПЖ. Примечательно, что при РПЖ ген глутатион-S-трансферазы pi 1 ( GSTP1 ), участвующий в репарации ДНК, гиперметилирован более чем в 90 %, а также в более чем 75 % интраэпителиальных неоплазий ПЖ высокой степени (ПИН ВС), что дает основания считать гиперметилирование GSTP1 в качестве раннего события в канцерогенезе ПЖ [27, 28]. DNMT1 как один из основных подтипов DNMT обладает опухолесупрессивной активностью на ранних стадиях РПЖ, но онкогенной активностью на его поздних стадиях [29]. У пациентов с локализованным РПЖ уровень экспрессии циркулирующего метилированного GSTP1 , полученного из плазмы крови перед операцией, предсказывал степень агрессивности опухоли (например, степень по шкале Gleason и стадия опухоли), а также возможный биохимический рецидив по ПСА [30, 31].

В недавнем исследовании показано, что лечение энзалутамидом способствует эпигенетическим изменениям в клетках РПЖ, что ведет к аберрациям сигнальных путей и в экспрессии генов, а в конечном итоге, к возникновению резистентности к энзалутамиду. ДНК-метилтрансфераза DNMT3B, в частности DNMT3B3, играет центральную роль в этом механизме. Авторы доказали, что добавление в схему лечения децитабина, который воздействует на DNMT3B, восстанавливало чувствительность к энзалутамиду в резистентных клетках РПЖ как in vitro, так и in vivo [32].

Связь метилирования ДНК в промоторе GSTP с РПЖ была описана уже 20 лет назад. Еще в 1998 г. H. Suzuki et al. описано много повторяющихся эпигенетических изменений, которые в дальнейшем были использованы в качестве биомаркера для оценки, диагностики и прогноза РПЖ. Так, например, гиперметилирование промотора CpG PTEN [33] или гиперметилирование гена-супрессора опухоли CDKN2A приводят к повышенной пролиферации клеток, тем самым способствуя канцерогенезу [34]. Однако только исследования последних лет пролили свет на молекулярные эффекты, лежащие в основе различных эпигенетических дисрегуляций [35]. Потеря экспрессии АР в 30 % случаев регулируется гиперметилированием промотора CRPC. При метастатическом кастрационно-резистентном раке предстательной железы (КРРПЖ) и опухолях, которые прогрессируют до состояния независимости от АР, основные эпигенетические регуляторы, а также структура хроматина достоверно подвергаются схожим изменениям [36].

За последнее десятилетие несколько исследований сравнили последовательности метилирования ДНК всего генома при ДГПЖ и на разных стадиях РПЖ [10]. Так, S.G. Zhao et al. использовали би-сульфитное секвенирование всего генома (Whole Genome Bisulfite Sequencing – WGBS) и подтвердили, что прогрессирующий РПЖ является в целом менее метилированным, чем первичный РПЖ, и который, в свою очередь, преимущественно менее метилирован, чем ткань ДГПЖ. Также авторы продемонстрировали гипометилирование промотора в АР и ключевых андроген-чувствительных генах на поздних стадиях РПЖ, по сравнению с образцами ДГПЖ [37]. В другой работе было показано, что глобальное гипометилирование ДНК коррелирует с генетической нестабильностью и, как следствие, потенциально способствует развитию и прогрессированию РПЖ [38]. Напротив, гиперметилирование ДНК является одним из наиболее часто наблюдаемых явлений и наиболее характерных эпигенетических изменений при РПЖ. Проведено множество анализов метилирования ДНК по всему геному, которые предполагают, что дифференциальное метилирование между дистальными и генными областями является одним из ключевых факторов возникновения и прогрессирования РПЖ [39]. Около 22 % КРРПЖ демонстрируют подтип гиперметилирования [37].

Нарушение метилирования ДНК обычно связано с агрессивными клинико-патологическими признаками и плохой выживаемостью [40]. Однако есть исследование, где авторы показали, что повышенный уровень метилирования, в частности гена SRD5A2 , был связан с лучшим прогнозом у пациентов с КРРПЖ, получавших андроген-депривационную терапию (АДТ). Подобные находки могут помочь лучше понять связь между эпигенетикой и развитием прогрессирующего

РПЖ и способствовать выбору лучших терапевтических стратегий [29].

Измерение метилирования ДНК можно использовать в качестве биомаркеров стратификации рисков у пациентов с РПЖ. Примером может служить эпигенетический тест «ConfirmMDx», который оценивает статус метилирования трех генов: GSTP1, APC и RASSF1 . Данный тест помогает отличать истинно отрицательные биопсии ПЖ от скрытого РПЖ, тем самым избегая ненужных повторных биопсий [41]. P.G. Patel et al. предложили определять панель метилирования GSTP1 , GAS6 и HAPLN3 для дифференциации РПЖ и ДГПЖ [42].

Деметилирование ДНК при РПЖ

О гиперметилировании ДНК известно уже давно. В то же время было мало понимания о влиянии деметилирования ДНК до открытия ферментов транслокации Ten-eleven (TET) и их способности к деметилированию путем окисления 5-метилцитозина 5mC до 5-гидроксиметилцитозина (5hmC), а также других производных [43]. Исследования показали, что общий уровень 5hmC в геномной ДНК существенно снижен во многих солидных опухолях, что связано с пониженными уровнями экспрессии членов семейства TET [44, 45]. Белки семейства TET способствуют локус-специфическому обратному метилированию ДНК в нормальных клетках, в конечном итоге регулируя экспрессию генов [44]. При транслокации TET в ДНК клеток РПЖ уровень 5hmC обычно снижен [45]. Белки семейства TET, а именно TET2, участвуют в передаче сигналов АР и играют важную роль в развитии РПЖ [46]. Также при нормальной своей функции белки TET подавляют прогрессирование опухоли и ее инвазию. В случае эпигенетических транслокаций TET указанный механизм нарушается. Уровни 5hmC значительно снижены при РПЖ, по сравнению с нормальными образцами ткани ПЖ [47]. Мутации в генах TET также были обнаружены с высокой частотой у пациентов с КРРПЖ. Кроме того, более низкие уровни TET связаны с плохим прогнозом у пациентов с ранним раком груди и РПЖ [48]. T.M. Storebjerg et al. предложили эпигенетический энзим 5hmC в качестве прогностического биомаркера РПЖ [49].

Метилирование гистонов при РПЖ

ДНК образует 1,65 супервитка вокруг ядра гистоновых белков. Вариативность гистонов является известным эпигенетическим механизмом и ведет к модификации в нуклеосоме, изменяя химические и физические свойства хроматина [50]. Существует четыре основных гистона, а именно H2A, H2B, H3 и H4. Их аминокислотные, особенно N-концевые, хвосты, являются потенциальными участками для различных типов посттрансляционных модификаций, таких как метилирование, ацетилирование, фосфорилирование и убиквитинирование [51].

Наиболее изученными при РПЖ являются метилирование и ацетилирование гистонов. Наиболее распространенными участками метилирования гистонов являются концевые остатки лизина, такие как H3K4, H3K9, H3K27, H3K36 и H3K79 H4K20, которые метилируют специфические ме-тилтрансферазы и деметилазы [52]. C. Cai и др. продемонстрировали, что деметилаза LSD1 (H3K9) может играть двойную роль при РПЖ. В присутствии высокой концентрации андрогенов LSD1 действует как ингибитор экспрессии АР. Однако в клетках КРРПЖ, где уровень андрогена обычно низок, экспрессия АР и АР-репрессированных генов увеличивается, что, в свою очередь, способствует пролиферации клеток КРРПЖ [53]. Применительно к терапии РПЖ in vivo оказалось, что блокировка деметилазы LSD1 (H3K9) как отдельно, так и в комплексе с лечением антагонистом АР резко снижала рост РПЖ [54].

Значительную роль в метилирования гистонов отводят каталитической субъединице EZH2 (Enhancer of Zeste Homolog 2) из фрагмента лизина H3K27 [55]. EZH2 – это каталитическая субъединица комплекса поликомб-репрессора 2 (PRC2). Триметилирование EZH2 ведет к развитию и прогрессированию различных видов рака, в том числе РПЖ, посредством эпигенетического подавления опухолевых супрессоров на гистоне H3 (H3K27me3) [56, 57]. Обнаружено, что уровни белка EZH2 прогрессивно увеличиваются в образцах метастатического РПЖ, по сравнению с ДГПЖ [58]. Ингибирование EZH2 продлевает время до наступления резистентности к энзалутамиду, тем самым повышая его эффективность при КРРПЖ [59]. В клинической когорте больных РПЖ было обнаружено, что более высокая экспрессия EZH2 коррелирует с худшим прогнозом [58]. EZH2 также играет важную роль в регуляции линейной пластичности, устойчивости к лекарственным препаратам и противоопухолевого иммунитета [56, 59]. Также обнаружено, что по сравнению с первичными опухолями при метастатическом РПЖ наблюдается повышенная экспрессия белка NSD2 (H3K36). Выявлена его связь со стадией заболевания, а также биохимическим рецидивом РПЖ [60]. Также было показано, что NSD2 участвует в иммунной регуляции РПЖ [61].

Ацетилирование гистонов при РПЖ

Существует более 40 различных вариантов ацетилирования гистонов [62]. Ацетилирование гистонов приводит к нарушению нормального уплотнения хромосомы, что позволяет факторам транскрипции получить доступ к генам и, собственно, инициировать их транскрипцию [63]. Ацетилирование гистонов тесно связано с активацией транскрипции, что влияет на многочисленные физиологические и патогенные процессы при РПЖ, и, напротив, деацетилирование и последующее метилирование остатков гистонов приводят к уплотнению гистонов, что снижает доступ регуляторных транскрипционных белков [64]. Например, ацетилтранфераза и деацетил-транфераза действуют как коактиватор и компрессор АР соответственно, таким образом, влияя на транскрипцию генов, опосредованную АР при РПЖ. Также они участвуют в механизме перепрограммирования локализованного РПЖ в мКРРПЖ, что подтверждает важность состояний хроматина для прогрессирования опухоли [65]. T.M. Severson и др. показали, что при максимальной андрогенной блокаде (МАБ) гистон H3 подвергается ацетилированию в H3K27ac, что связано с резистентностью к терапии [66]. W.A. Whyte et al. и F. Valdes-Mora et al. показали, что некоторые суперэнхансеры (небольшие фрагменты ДНК, которые стимулируют транскрипцию) были напрямую связаны с ацетилированием гистонов H3K27ac, которые играют решающую роль в качестве онкогенных драйверов РПЖ. Активация данных энхансеров, связанных с АР, достоверно коррелировала с ацетилированием гистонов и прогрессией РПЖ [67, 68]. В другой работе показано, что лечение ингибиторами гистондеацетилазы приводило к торможению эпигенетического подавления и восстанавливало экспрессию простат-специфического мембранного антигена – PSMA и in vitro, и in vivo [69].

Эпигенетические факторы и нейроэндокринная дифференцировка РПЖ Нейроэндокринные клетки (НЭК) секретируют несколько нейрональных маркеров (хромогранин A, нейрон-специфическая енолаза, синаптофизин и CD56), а также факторы, стимулирующие рост. Однако в НЭК отсутствует экспрессия АР [70, 71]. В нормальной ПЖ НЭК могут играть функциональную роль в регуляции роста и дифференцировки эпителиальных клеток андроген-независимым образом [72]. В нормальной ткани зрелой ПЖ приблизительно 1 % популяции клеток составляют НЭК, которые распределены по эпителию ПЖ отдельно или небольшими скоплениями. Мутация TP53 в НЭК может нарушить численный баланс и привести к быстрому преобразованию части клеток аденокарциномы РПЖ в НЭК [73]. Происходит дифференцировка НЭК, что сопровождается ростом их числа, развитием резистентности к АДТ и ассоциируется с плохим прогнозом [74].

Подобный нейроэндокринный переход как проявление линейной пластичности опухоли проявляется при многих типах рака, включая РПЖ [75]. Линейная пластичность обозначает процесс, посредством которого раковые клетки изменяются из одного морфологического и функционального типа клеток в другой под влиянием окружающей среды [40]. В ряде публикаций линейная пластичность аденокарциномы ПЖ в НЭ опухоль получила обозначение терапевтически-индуцированного нейроэндокринного РПЖ (т-НЭРПЖ), поскольку НЭ фенотип опухоли был приобретен и является причиной длительной АДТ. Термин «т-НЭРПЖ» появился сравнительно недавно в некоторых публикациях и является синонимом нейроэндокринной дифференцировки (НЭД) РПЖ [76, 77]. В своем материале во избежание путаницы мы будет использовать оба термина одновременно.

Лучшее понимание генетических и эпигенетических механизмов, посредством которых развивается НЭД РПЖ (тНЭРПЖ), является важным направлением для разработки терапевтических схем для пациентов с подобным видом рака [74]. Согласно исследованиям, на фоне МАБ и по мере появления резистентности к МАБ 15–20 % опухолей подвергаются гистологической трансформации, когда из клеток АР-экспрессирующей аденокарциномы в результате эпигенетических мутаций нарастает пул НЭК [78]. Большое число исследований сообщает о нескольких факторах, лежащих в основе и регулирующих прогрессирование НЭД РПЖ (т-НЭРПЖ). К ним относятся исследования потери супрессоров опухолей TP53 , RB1 и PTEN , активации множественных факторов транскрипции, включая N-Myc (наряду с активацией AURKA и AURKB), ASCL1, SOX2, BRN2 , REST , ONECUT2 и CREB, роли адренергических рецепторов (например, ADRB2 и GRK3), эпигенетических модуляторов и ремоделеров хроматина (например, белков репрессивного комплекса Polycomb 2 EZH2 и SMARCA4) [79]. Например, одновременная потеря RB1 и TP53 присутствовала в 53,3 % биопсий при НЭД РПЖ (т-НЭРПЖ), по сравнению с 13,7 % при КРРПЖ [80].

R. Chen et al. описывают, что трансдифференцировка и прогрессирование КРРПЖ в так называемый терапевтически-индуцированный НЭРПЖ – это результат воздействия нескольких молекулярных агентов и их посредников. Согласно модели, представленной в статье, гены N-Myc, RB1 и TP53 способствуют резистентности к АДТ посредством линейной пластичности; гены SRRM4, REST, BRN2 и FOXA1/2 играют решающую роль