Эстриол в формировании толерогенного фенотипа мононуклеарных лейкоцитов больных рассеянным склерозом

Поскольку состояние беременности связывают со смещением баланса Т-хелперов (Th) с 1-го типа на 2-й, у беременных происходит улучшение течения Th1-опосредованных аутоиммунных заболеваний [Lorenzi, Ford, 2002], одним из которых является рассеянный склероз (РС). В основе данной патологии лежит аутоиммунный процесс, характеризующийся иммунным ответом в отношении собственного белка миелина и разрушением нервных волокон при участии Т-лимфоцитов и макрофагов [Steinman, 1996]. При этом известно, что одним из механизмов формирования иммунологической толерантности является активация индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) [Terness et al., 2005], которая может способствовать генерации Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) [Chen et al., 2008]. Кроме того, одним из наиболее значимых механизмов формирования толерантности, в том числе при аутоиммунных заболеваниях, является поддержание баланса между регуляторными субпопуляциями Th17/Treg [Darmochwal-Kolarza et al., 2012].

Эстриол (Е 3 ) называют «гормоном беременности», поскольку у небеременных женщин он практически не определяется, а для его синтеза необходима скоординированная работа ферментативных систем как матери, так и плода [Kase, Reyniak, 1985].

В наших исследованиях продемонстрирована способность данного гормона эффективно регулировать различные функции лейкоцитов человека [Ширшев, Некрасова, 2008; Некрасова, Ширшев, 2010; Ширшев, Некрасова, Орлова, 2011]. Принимая во внимание тот факт, что при беременности меняется гормональный баланс, а продукция Е 3 существенно возрастает, данный гормон является одним из вероятных кандидатов на роль фармпрепарата при аутоиммунных заболеваниях, связанных с повышенной активностью Th1-клеток. Продемонстрирован благоприятный эффект от применения Е 3 в экспериментальной модели РС у мышей [Jansson, Olsson, Holmdahl, 1994; Palaszynski et al., 2004]. Однако данные исследования единичны и требуют дальнейшего изучения.

Цель данной работы – оценка влияния Е 3 на активность IDO моноцитов, а также созревание Treg и Th17 клеток больных РС в сравнении со здоровыми донорами.

Материалы и методы

В работе исследовали мононуклеары периферической крови (МПК) пациентов с РС, согласно модифицированным диагностическим критериям МакДональда 2005 г., с ремитирующим типом течения заболевания, не подвергавшихся терапии препарата-

ми, изменяющими течение РС, иммуномодулирующей терапии и находящихся в стадии клинической ремиссии; средний возраст пациентов - 36.3 ²9.52 лет, средний стаж заболевания – 3.67 93I.6I лет, с показателем по расширенной шкале оценки инвалидизации EDSS (Expanded Disability Status Scale) от 1.5 до 3.5 баллов. В качестве контроля использовали МПК здоровых доноров (средний возраст 32.7 9 2.68 лет). Суспензию мононуклеаров получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-ве-рографина (1.077 г/см³).

Е 3 использовали в концентрациях, соответствующих уровням данного гормона во время физиологически протекающей беременности: 2 нг/мл – I триместр и 20 нг/мл – III триместр. В качестве контроля использовали растворитель гормона.

Активность IDO в МПК определяли спектрофотометрически по изменению концентрации кинуренина - первого стабильного метаболита пути распада триптофана [Braun et al., 2005]. Для этого МПК, стимулированные интерфероном липополисахаридом (ЛПС) (100 нг/мл, «Sigma», США), культивировали в растворе Хенкса, содержащем 100 мкM триптофана («Sigma», США), в течение 4 ч. с гормоном. Затем к 100 мкл клеточного супернатанта добавляли 50 мкл 30%-ной трихлоруксусной кислоты, встряхивали на вортексе и центрифугировали в течение 5 мин. Затем в лунки 96-луночного планшета вносили 75 мкл супернатанта, смешивали с равным объемом реактива Эрлиха. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на многоканальном спектрофотометре Biohit BD 800 («Bio-Tek Instruments, Inc.», США). Для определения концентрации кинуренина в пробах строили кривую по калибровочным пробам 0–100 мкМ кинуренина («Sigma», США).

Для оценки фенотипических маркеров выделенные МПК инкубировали в пластиковых пробирках «Эппендорф» в полной питательной среде (среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ буфера HEPES, 2 мМ L-глютамина, 100 мкг/мл гентамицина) в течение 72 ч. при 372^С в условиях 5% СО2 с Е3. По окончании инкубации оценивали фенотип лимфоцитов на проточном цитофлюориметре («Becton Dickinson», США). Жизнеспособность лимфоцитов, определяемая в тесте с эозином после 72 ч. инкубации с Е3, составляла 95–98%. Окрашивание поверхностных и внутриклеточных маркеров осуществляли согласно методике производителя моноклональных антител («eBioscience», США). Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции лимфоцитарного окна использовали соответствующие изотипические контроли. Количество Treg оценивали как процент CD4+-лимфоцитов (Anti-human CD4 FITC), экспрессирующих FOXP3 (Anti-Human FOXP3 PE) и CTLA-4 (Anti-human CTLA-4 APC). Экспрессия внутриклеточного фак- тора FOXP3 является наиболее надежным маркером Treg-клеток, сильнее коррелирующим с супрессорной активностью, чем коэкспрессия CD4 и CD25 [Fontenot et al., 2005]. А основным показателем функциональной активности Treg считается экспрессия маркера CTLA-4 (цитотоксический Т-лим-фоцитарный антиген-4). Данная молекула участвует в реализации ингибиторной функции регуляторных лимфоцитов и поддерживает гомеостаз иммунной системы при ответе на антигены [Brunner et al., 1999].

Количество Th17 оценивали как процент CD4+-лимфоцитов (Anti-human CD4 FITC), экспрессирующих транскрипционный фактор ROR-gamma-t (Anti-mouse/human ROR-gamma-t PE) и интерлейкина (IL)-17 (Anti-Human IL17A PE-Cy7). Специфическим транскрипционным фактором для данной популяции клеток является ROR-gamma t (ядерный ор-фановый рецептор-гамма для ретиноидов), имеющий критическое значение для продукции IL-17 [Korn et al., 2009].

Результаты и их обсуждение

Одним из факторов, способствующих поддержанию периферической толерантности, является экспрессия IDO антигенпрезентирующими клетками, к которым, в частности, относятся моноциты периферической крови. Данный фермент конвертирует триптофан в кинуренины, что, в свою очередь, приводит к гибели цитотоксических лимфоцитов и Th1 [Braun, Longman, Albert, 2005].

Установлено, что Е 3 вне зависимости от концентрации усиливает активность IDO в МПК здоровых доноров. Исходная активность IDO больных РС была ниже, чем здоровых доноров. Однако под влиянием Е 3 в концентрации, соответствующей III триместру беременности, активность IDO повышалась, причем даже в большей степени, чем у здоровых доноров (табл. 1).

Таблица 1

Модуляция активности ЛПС-индуцированной IDO под влиянием Е3

Гормональное воздействие	Концентрация кинуренина, мкМ
	Здоровые доноры	Больные РС
Контроль	7.14±0.516	5.03±0.549#
Эстриол, 2 нг/мл	9.16±0.639*	5.50±0.317
Эстриол, 20 нг/мл	10.54±0.449*	11.42±0.947*#

Примечание. Здесь и далее * – р < 0.05 по сравнению с контролем; # – р < 0.05 по сравнению со здоровыми донорами.

Установлено, что уровень CD4+FOXP3+CTLA-4+ лимфоцитов больных РС, был изначально ниже, чем у здоровых доноров. Под влиянием Е3 в высокой концентрации увеличивалось количество данных клеток у здоровых доноров, и вне зависимости от концентрации гормон повышал процент Treg у больных РС (табл. 2).

Таблица 2

Изменение процентного содержания Treg-лимфоцитов под воздействием Е3

Гормональное воздействие	Процент CD4+FOXP3+CTLA-4+ лимфоцитов
	Здоровые доноры	Больные РС
Контроль	1.54±0.358	0.82±0.180#
Эстриол, 2 нг/мл	1.59±0.339	1.94±0.501*
Эстриол, 20 нг/мл	2.51±0.596*	1.46±0.332*

Следовательно, данный гормон не только усиливает экспрессию супрессорного фактора FOXP3, но и повышает процент клеток, несущих молекулу CTLA-4. Показано, что при контакте CTLA-4 на Treg с лигандами В7 на антиген-презентирующих клетках происходит усиление экспрессии IDO в последних [Fallarino et al., 2003]. В свою очередь, клетки, экспрессирующие повышенные уровни IDO, способствуют генерации индуцибельных Treg из CD4+CD25- лимфоцитов [Chen et al., 2008].

Субпопуляция IL-17-продуцирующих лимфоцитов (Th17) сейчас является одной из самых перспективных в плане исследования механизмов развития и терапии РС [Aranami, Yamamura, 2008]. В обеих исследуемых концентрациях Е 3 понижал процент CD4⁺RORγt⁺IL-17⁺ лимфоцитов в культурах клеток больных РС и в низкой концентрации – в культурах клеток здоровых доноров (табл. 3).

Таблица 3

Изменение процентного содержания Th17-лимфоцитов под воздействием Е3

Гормональное воздействие	Процент CD4+RORγt+IL-17+ лимфоцитов
	Здоровые доноры	Больные РС
Контроль	1.74±0.738	2.16±0.753
Эстриол, 2 нг/мл	0.43±0.149*	1.607±0.697*#
Эстриол, 20 нг/мл	1.31±0.417	0.36±0.146*#

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что Е 3 в концентрациях, характерных для беременности, способствует повышению экспрессии IDO, а также меняет соотношение регуляторных субпопуляций Treg и Th17 как здоровых доноров, так и больных РС.