Эволюционно-генетические основы симбиотической инженерии растений: мини-обзор

Микробно-растительные симбиозы (МРС) играют ключевую роль в питании растений (фиксация N2, ассимиляция питательных веществ почвы), их защите от патогенов и фитофагов (синтез антибиотиков и токсинов), а также в регуляции развития и адаптации к стрессам (синтез фитогормонов и витаминов, влияющих на ростовые процессы) (1). Экологиче-

^* Работа поддержана РНФ, грант ¹ 14-26-00094П.

ская значимость МРС определяется тем, что наземные растения представляют собой симбиогенную по происхождению форму жизни: они колонизировали сушу в тесной кооперации с микробными сообществами, состоявшими из микоризных грибов-гломеромицетов, ассоциированных с фото- и гетеротрофными бактериями (2). Создание экологически устойчивых агроценозов, высокая продуктивность которых достигается при минимальном использовании химических удобрений и средств защиты, требует существенного повышения симбиотической активности растений (3, 4).

Несмотря на высокую генетическую изученность МРС, микробные препараты для инокуляции сельскохозяйственных культур до сих пор готовят почти исключительно на штаммах дикого типа, выделенных из природных источников (растений, почвы) методами аналитической селекции (5, 6). Хотя генетический контроль симбиотической эффективности (СЭ) — способности микроорганизмов повышать продуктивность растений — изучен весьма подробно (7), генно-инженерные и биотехнологические подходы пока не нашли широкого применения для улучшения этого признака. Причины этого заключаются в сложности контроля СЭ, которая зависит от многофакторного взаимодействия генотипов нескольких партнеров, находящихся под влиянием варьирующих внешних условий, а также в отсутствии генетически обоснованных программ управления симбиотрофным развитием растений. Эти программы должны быть основаны на механизмах их природной коэволюции с микроорганизмами, которая может быть изучена на фенотипическом (8), геномном (9) и транскиптомном (10) уровнях.

Оптимальная модель для разработки методологии конструирования МРС — N₂-фиксирующий бобово-ризобиальный симбиоз, развитие которого со стороны бактерий определяется двумя группами генов. Это nod -гены, контролирующие синтез липо-хито-олигосахаридных Nod-факторов (NF), которые активируют программу клубенькообразования, и nif / fix -гены, определяющие синтез и функционирование нитрогеназного комплекса in planta (1). Изучение бобово-ризобиального симбиоза показало, что в природных условиях эволюция МРС направлена на повышение эффективности кооперативного (мутуалистического) взаимодействия партнеров, определяемой на основе показателей их биологической продуктивности — численности популяций, скорости размножения, биомассы. При этом могут быть выделены три этапа эволюции симбиоза, на которых возрастает СЭ.

Плейотропный симбиоз — наименее специализированная его форма, характеризуемая подвижным равновесием кооперативных и антагонистических эффектов. Оно зависит не только от проявления микроорганизмами благоприятных для хозяина признаков (например, N2-фикси-рующей активности), но и от взаимодействия симбионтов с защитными системами растений, контролирующими гомеостаз их внутренней среды. Плейотропные симбиозы основаны на отрицательных обратных связях партнеров, обеспечивающих стабильное сосуществование растений и микроорганизмов, а также их сбалансированный полиморфизм по признакам симбиоза (11).

Взаимная эксплуатация партнеров — более специализированная и эффективная форма симбиоза, основанная на эквивалентном метаболическом обмене растений и микроорганизмов, включая формирование встречных потоков углерода и азота (12, 13). Благодаря становлению надорганизменных путей обмена веществ и энергии между партнерами устанавливаются положительные обратные связи: чем больше продуктов N2-фик-сации получает растение, тем выше активность фотосинтеза и тем больше С-соединений оно поставляет своим микросимбионтам. Важную роль в по-465

вышении СЭ играют ослабление антагонизма партнеров, например, утрата медленнорастущими ризобиями синтеза ризобиотоксинов (14), и модификация сигнально-рецепторных комплексов, включая образование ризобия-ми NF и поверхностных полисахаридов, а также белков-эффекторов, передаваемых в растительные клетки через системы секреции третьего типа (15).

Межвидовой альтруизм — глубоко специализированная форма симбиоза, основанная на утрате жизнеспособности внутриклеточными микросимбионтами, модифицированными для выполнения полезных хозяину функций, например бактероидами ризобий, развивающими аномально высокую нитрогеназную активность, что сопровождается «отказом» от размножения. При этом общая приспособленность популяций микросимбионтов возрастает благодаря групповому (междемовому, родственному) отбору в пользу клонов-альтруистов, обладающих повышенной СЭ (16). В процессе эволюции увеличивается целостность симбиоза, основанная на устойчивых регуляторных связях между микробными и растительными клетками клубенька, а также между клубеньками и надземными органами растений, в которых осуществляется фиксация N2 и CO2.

В нашей статье представлена эволюционно обоснованная схема конструирования высокоэффективных микробно-растительных симбиозов. Она включает активацию целевой метаболической функции симбионтов в сочетании с повышенной способностью конкурировать за инфицирование хозяев; придание симбионтам новых ростстимулирующих функций, которые обеспечивают переключение хозяев на симбиотрофное развитие; согласованное повышение морфометрических и биохимических параметров растений посредством усиления «альтруистических» свойств их симбионтов.

1. Повышение нодуляционной конкурентоспособности (НКС ) ризобий при изменениях генов, контролирующих ранние стадии симбиоза (17)

Виды Rhizobium и Sinorhizobium	Растения-хозяева	Гены (их продукты)	Возрастание НКС (%)
Амплификация генов — позитивных регуляторов НКС R. leguminosarum bv. trifolii          Trifolium pratense        rosR (активатор синтеза экзополисахаридов)         41 → 69 S. meliloti         Medicago sativa          cmp-107 (гидрофобный белок с неизвестной        40 → 51 функцией) S. meliloti         M. sativa                putA (пролин-дегидрогеназа)                         71 → 87 Инактивация генов — негативных регуляторов НКС S. medicae         M. truncatula , M. sativa  nolR (репрессор nod -генов)                          25 → 71 S. meliloti         M. sativa               SMb21195 (ABC-переносчик олигопептидов)        57 → 85 S. meliloti         M. truncatula , M. sativa  truB (НАДФ-зависимая дегидрогеназа)               50 → 68 R. leguminosarum bv. viciae         Pisum sativum           praR (репрессор образования биопленок)           10 → 90
П р и м еч а ни е. Возрастание НКС определяли при совместной инокуляции растений генетически модифицированными и родительскими штаммами (1:1).

Конкурентные процессы. Взаимовыгодная кооперация микроорганизмов и растений в системах мутуалистического симбиоза сопровождается интенсивной конкуренцией, происходящей как между взаимодействующими партнерами, так и в популяциях каждого из них. Наиболее жесткая конкуренция наблюдается между разными генотипами симбионтов при инфицировании хозяев. У ризобий способность конкурировать за образование клубеньков (нодуляционная конкурентоспособность, НКС) определяется обширной системой cmp-генов, включающей позитивные и негативные регуляторы ранних симбиотических функций — узнавания хозяев и сигнального взаимодействия с ними, колонизации ризосферы и ри-зопланы, инфицирования корней (17). Их изучение позволило предложить разнообразные генетические подходы к повышению НКС, включая амплификацию позитивных регуляторов этого признака и инактивацию его негативных регуляторов (табл. 1), а также совмещение в одном микробном генотипе факторов высокой СЭ и НКС.

На поздних стадиях развития клубеньков, связанных с переходом растений к симбиотрофному питанию азотом, усиливается конкуренция между бактериями и растительными клетками клубенька за продукты фотосинтеза, которые поступают из надземных органов и используются ри-зобиями для энергообеспечения азотфиксции и размножения. В этой конкуренции могут быть задействованы факторы антагонизма микросимбионтов с хозяевами, включая ризобиотоксины, например 2-амино-4-(2-ами-но-3-гидропропокси)-транс-3-еноиковую кислоту, образуемую эволюционно примитивными медленнорастущими симбионтами Bradyrhizobium el-kanii , а также белки-эффекторы, передаваемые бактериями в растительные клетки через системы секреции третьего типа (СС3Т).

Эти факторы, характерные для примитивных форм симбиоза, по мере повышения его эффективности эволюционируют в сторону смягчения патогенных эффектов. Так, в эволюции медленнорастущих ризобий происходила утрата синтеза ризобиотоксинов, которая сопровождалась повышением N₂-фиксирующей активности клубеньков (14). Иные закономерности характерны для эволюции СС3Т, которые в процессе диверсификации ризобий усложнялись и у быстрорастущих ризобий ( Rhizobium , Sinorhizobium ) приобрели функции дополнительных по отношению к NF регуляторов хозяйской специфичности (15). Более того, в эволюционно продвинутых бобово-ризобиальных симбиозах факторы антагонизма используются для повышения эффективности кооперации партнеров. Например, богатые цистеином NCR-белки бобовых галегоидного комплекса, сходные с факторами защиты растений от патогенов (дефензинами), служат индукторами дифференцировки эндосимбиотических клеток Rhizobium и Sinorhizobium в неспособные к размножению бактероиды, обладающие чрезвычайно высокой нитрогеназной активностью (18).

Симбиотрофное развитие растений. Попытки конструирования штаммов ризобий с повышенной СЭ показали, что усиление только одной целевой функции (N₂-фиксации) вызывает ограниченный эффект: рекомбинанты ризобий люцерны ( Sinorhizobium meliloti ) с повышенным (от 1 до 2-5) числом копий генов, контролирующих синтез нитрогеназы ( nif ) и снабжение бактероидов дикарбоновыми кислотами ( dct ), обеспечивают 70-80 % прибавки по накоплению азота в растениях, однако их масса возрастает лишь на 15-20 % (19). Эта диспропорция, по-види-мому, связана с тем, что растительные и микробные клетки конкурируют за углеводы, необходимые для энергообеспечения нитрогеназной реакции и для ассимиляции ее продуктов. При усилении конкуренции партнеров за углерод возможно замедление оттока азотных соединений в надземные органы. Однако такая конкуренция может быть ограничена посредством создания штаммов ризобий, стимулирующих развитие побеговых меристем благодаря синтезу фитогормонов или витаминов (20). При этом возрастает соотношение между длиной и массой побегов и корнями (изменяется габитус растений), что приводит к наиболее полному использованию растениями фиксируемого азота, а также преодолению метаболического дисбаланса симбиосистемы, который определяется перерасходом энергии в связи с усилением N₂-фиксирующей активности.

В эволюции бобово-ризобиального симбиоза повышение СЭ достигалось двумя способами (1): резким возрастанием N2-фиксирующей активности бактерий, преобразуемых в нежизнеспособные бактероиды, что характерно для микросимбионтов бобовых галегоидного комплекса

(включая трибы Galegae , Trifolieae и Vicieae ), и переходом растений к детерминированной структуре клубеньков, типичной для триб Loteae и Phaseoleae (в этом случае бактероиды сохраняют способность к размножению и после отмирания клубеньков переходят в состав почвенных популяций). Реализация второго («экономного») способа обеспечила существенное снижение энергоемкости симбиоза, а в трибе Phaseoleae — также диверсификацию путей усвоения фиксированного и почвенного азота. Эта диверсификация связана с тем, что в клубеньках фасоли и сои фиксированный азот включается в состав особых транспортных форм — уреидов (аллантоина и аллантоиновой кислоты), которые передаются в надземные органы, позволяя растениям сочетать симбиотрофное и автотрофное азотное питание. В то же время при реализации первого («затратного») способа симбиотрофное питание ограничено, поскольку в клубеньках люцерны, гороха и клевера транспортными формами азота служат те же амиды, которые образуются при усвоении азотных удобрений.

В связи с этим одним из направлений конструирования симбио-трофных растений может быть совмещение детерминированной структуры клубеньков со способностью активировать дифференцировку ризобий в нежизнеспособные бактероиды (21). Возможность такого совмещения была показана в опытах по переносу от однолетней люцерны ( Medicago trun-catula ) в лядвенец японский ( Lotus japonicus ) гена dfn1-1 , контролирующего развитие бактероидов. В результате интродукции дикого аллеля этого гена лядвенец, сохранив детерминированную структуру клубеньков, приобрел характерную для люцерны способность формировать монобактериальные симбиосомы с повышенной степенью дифференцировки бактероидов (18).

Межвидовой альтруизм. Утрата бактериями функций свободного существования — важнейший фактор их перехода к мутуалистическому взаимодействию с растениями. На ранних этапах эволюции клубенькового симбиоза у медленнорастущих ризобий ( Bradyrhizobium ) произошла утрата фототрофности (она была функционально замещена системой клубенькообразования, обеспечившей бактериям доступ к продуктам растительного фотосинтеза) и диазотрофности (в связи со специализацией nif -генов к функционированию in planta) (22). Эта тенденция получила развитие на поздних этапах эволюции симбиоза, когда у быстрорастущих ризобий ( Rhizobium , Sinorhizobium ) возникла способность к трансформации в нежизнеспособные бактероиды, обладающие чрезвычайно высокой N₂-фиксирующей активностью. NCR-белки растений, стимулирующие эту трансформацию (23), сыграли роль ключевых факторов перехода партнеров к альтруистическим отношениям, которые по мере повышения целостности симбиоза преобразуются из внутривидового адаптивного механизма, ограниченного популяцией симбионтов, в контролируемый хозяином «межвидовой альтруизм» (16, 24).

В рамках генно-инженерных программ усиление этой тенденции может быть достигнуто посредством инактивации eff -генов ризобий, определяющей повышение СЭ благодаря утрате функций, которые необходимы для автономного выживания бактерий в почве, однако интерферируют с развитием эффективного симбиоза. К их числу относится синтез бактериями запасных питательных веществ (конкурирует с катаболизмом продуктов фотосинтеза, снабжающего нитрогеназный комплекс энергией), усвоение «несимбиотических» (не участвующих в питании бактероидов) источников углерода (например, сахаров), а также образование поверхностных компонентов микробной клетки (экзо- и липополисахаридов), которые служат элиситорами защитных реакций растений, ограничиваю-468

щих размножение эндосимбионтов (25). В системе S. meliloti—M. sativa утрата бактериями этих функций сопровождается сбалансированным повышением биомассы и накопления азота у растений, что свидетельствует об оптимизации соотношения их биохимических и морфометрических параметров. Актуальность этого направления симбиотической инженерии определяется тем, что при развитии бактерий в почве они часто теряют признаки мутуализма, однако сохраняют вирулентность и переходят к паразитированию на растениях (26). Очевидно, что адаптивный потенциал надвидовой системы может быть полностью реализован только с использованием методов симбиотической инженерии и агробиотехнологии, которые позволят предотвратить утрату бактериями признаков мутуализма, часто происходящую в стрессовых условиях.

Перспективы симбиотической инженерии. Рассмотренные подходы к конструированию высокоэффективных МРС могут быть объединены в универсальный генно-инженерный алгоритм со следующими составляющими: усиление целевых биохимических функций симбиоза; их координация с ростовыми процессами, обеспечивающая симбиотроф-ное развитие растений; снижение выживаемости микросимбионтов во внешней среде, обеспечивающее возрастание эффективности их взаимодействия с хозяевами (рис.).

Основные этапы конструирования высокоэффективных микробно-растительных симбиозов (на примере N 2 -фиксирующего бобово-ризобиального симбиоза): А — повышение нитрогеназной активности бактерий, Б — оптимизация габитуса растений-хозяев, В — инактивация бактериальных генов — негативных регуляторов симбиоза; M — надземная масса растений, N — накопление азота в надземной массе.

Изучение бобово-ризобиального симбиоза показало, что переключение бобовых с автотрофного питания азотом (усвоения удобрений и азотных соединений почвы) на симбиотрофное питание (ассимиляцию продуктов N2-фиксации) сопряжено с изменением общего плана развития растений. При инокуляции ризобиями их габитус меняется в пользу надземной части. Это может быть связано с активацией микросимбионтами развития побеговых меристем либо с ингибированием корневых меристем, что повышает эффективность использования продуктов N2-фикса-ции для формирования вегетативной массы и семян (20).

Предложенный нами алгоритм симбиотической инженерии может быть использован для повышения эффективности уже существующих форм МРС, однако для конструирования новых симбиозов необходимы принципиально иные подходы. В настоящее время широко обсуждается создание азотфиксирующих систем у небобовых (злаковых) культур, которое еще более 40 лет назад было определено в качестве приоритетной задачи генетической инженерии растений (27). Однако оказалось, что наиболее простой путь решения этой задачи, связанный с интродукцией генов азотфиксации в ядерные геномы растений, не оптимален: экспрессия бактериальных nif-генов и формирование активной нитрогеназы in planta затруднены, поскольку работа этого фермента по непонятным пока причинам несовместима с метаболизмом эукариотической клетки (27, 28).

2. Подходы для конструирования азотфиксирующих растений (27, 39)

Подход

Достоинства

Экспериментальное обоснование

Ограничения

Введение nif-генов в Стабильное наследова- Недостаточное (N2-фиксирующие Отсутствие экспрессии nif-ядерные хромосомы ние nif-генов         эукариоты неизвестны)          генов (синтеза функцио- растений                                                                нально активной нитроге назы) в цитозоле эукариотической клетки

Создание N2-фикси- Изоляция нитрогеназы Генетическое родство органелл и Ограниченный объем и рующих органелл на от цитозоля раститель- свободноживущих N2-фиксаторов низкая стабильность ге-основе митохондрий ной клетки                                          номов органелл или пластид

Создание небобовых Возможность исполь- Активация гомологов Sym-генов Неполная экспрессия (злаковых) растений, зовать гомологи Sym- бактериальными сигналами (Nod- Sym-генов у небобовых способных формиро- генов, широко распро- факторами). Образование при дей- при инокуляции ризобия-вать N2-фиксирую- страненные у высших ствии 2,4-дихлорфеноксиуксус- ми, низкая стабильность щие клубеньки растений             ной кислоты (2,4-D) клубенькопо- образуемых при этом добных структур, заселяемых ри- симбиотических структур зосферными N2-фиксаторами (Azospirillum)

Более реалистичным представляется использование подходов сим-биогенетики, включая введение nif -генов в органеллы растительной клетки — митохондрии или пластиды, многие свободноживущие аналоги которых ( α -протеобактерии и цианобактерии) способны к азотфиксации (табл. 2). В модельных опытах было показано, что функционально активные белки-нитрогеназы могут быть синтезированы в митохондриях дрожжей, однако в их цитозоле эти белки остаются неактивными даже в том случае, если дрожжи культивируют в анаэробных условиях, благоприятных для работы нитрогеназы (табл. 3).

• 3.    Образование функционально активной малой субъединицы нитрогеназы (Fe-белка NifH) в рекомбинантных дрожжах (40)

Локализация синтеза NifH в клетках дрожжей	Ко-синтезируемые белки	Активность редукции
		С 2 Н 2    1	N 2
Митохондрии	NifM	1600±27	826±60
Митохондрии	Отсутствуют	0	0
Цитозоль (+ О2)	NifM	0	0
Цитозоль ( - О2)	NifM	102±2	0
Контрольные белки из Azotobacter vinelandii		1652±23	849±25

П р и м еч а ни е. Активность редукции измеряли in vitro в расчете на 1 мг MoFe-белка NifDK (большой субъединицы нитрогеназы): для С2Н2 — по образованию этилена, нМ/мин, для N2 — по образованию аммония, нМ/мин.

Важно отметить, что симбиосомы с бактероидами, образуемые в клубеньках бобовых и представляющие собой структурно-функциональные аналоги митохондрий и пластид, с которыми симбиосомы вступают в тесные метаболические отношения, могут рассматриваться как прототипы новых клеточных органелл — аммониопластов (29). Начальные этапы их возникновения иллюстрируют генетически редуцированные цианобактерии Nostoc azollae — строго облигатные симбионты папоротника Azolla fil-iculoides , передаваемые вертикально при его споровом размножении (30). В случае бобово-ризобиального симбиоза одним из подходов для вовлечения таких органелл в клеточный цикл растений может быть их регенерация из культур клеток, содержащих симбиосомы с бактероидами.

Еще одно перспективное направление инженерии N2-фиксирую-щего симбиоза — формирование у небобовых растений генетических программ развития клубеньков. Для этого могут быть использованы гомологи Sym-генов бобовых, многие из которых (гены LysM- и LRR-содержащих рецепторов) имеются у всех высших растений и в определенных условиях активируются Nod-факторами ризобий (31). У злаковых культур (пшеницы и кукурузы) посредством обработки аналогом ауксина — 2,4-дихлор-феноксиуксусной кислотой (2,4-D) удалось индуцировать развитие клубенькоподобных структур, которые оказались удобными нишами для хостинга ризосферных азотфиксаторов, например Azospirillum. Поселяясь в этих «псевдоклубеньках», азоспириллы развивают гораздо более высокую нитрогеназную активность, чем на поверхности корней, а также эффективно передают растениям продукты N2-фиксации (32).

Дальнейшее развитие симбиотической инженерии может быть связано с использованием эндофитных бактерий (33), в первую очередь тех, которые наследуются растениями через семена (34). Этой способностью обладают также эндофитные грибы семейтва Спорыньевые ( Neotyphodium ), способные подавлять вредителей зерновых культур посредством выработки токсичных алкалоидов (35). Для симбиотической инженерии представляют интерес β -протеобактерии рода Burkholderia , включающего фитопатоген-ные и симбиотические, в том числе N₂-фиксирующие, формы. Показано, что биоконтроль паразитических штаммов B. glumae может быть осуществлен симбиотическим штаммом Burkholderia sp. с введенным в него геном iiaA , который нарушает экспрессию генов вирулентности патогена, определяемую механизмом «чувство кворума» (quorum sensing) (36). Значительным фитостимулирующим потенциалом обладают эндофиты листьев — эволюционно молодая группа симбиотических бактерий, способных стимулировать фотосинтез и подавлять развитие листовых патогенов (37). Ограничения, накладываемые на эволюцию перечисленных типов МРС условиями природных экосистем, могут быть преодолены с помощью методов генной и клеточной инженерии, симбиогенетики и биотехнологии (38).

Таким образом, в настоящее время накоплены обширные данные о генетическом контроле, молекулярной организации и механизмах эволюции микробно-растительных симбиозов, что позволяет формировать генетически обоснованные программы их конструирования для адаптивного земледелия и растениеводства. Это позволит заменить экологически опасные агрохимикаты (удобрения, средства защиты растений) совершенно безопасными и гораздо более дешевыми микробными препаратами. Создание хозяйственно ценных микробно-растительных симбиозов включает две задачи: генетическое улучшение симбиозов, сформировавшихся в процессе природной коэволюции микробов и растений, и конструирование принципиально новых симбиозов. Успешное развитие симбиотической инженерии требует широкой кооперации специалистов разного профиля и остается одной из наиболее актуальных задач современной агробиологии.