К механизму диуретической активности фуросемида. Роль гидрофобного сегмента молекулы

Ранее нами была показана ключевая роль карбоксильной группы в обеспечении диуретической и салуретичес-кой активности фуросемида. Замещение активного атома водорода этой группы на гидрофобный метильный и этильный радикалы полностью лишало фуросемид возможности влиять на функцию почек в эксперименте у крыс [1]. В последующих работах нами было установлено, что изменения геометрии молекулы фуросемида, вызывающие выраженные стерические затруднения при образовании водородной связи с активным атомом водорода карбоксильной группы, приводят к потере мочегонной активности препарата. Было также показано, что пространственное строение молекулы фуросемида в значительной степени зависит от наличия в его структуре внутримолекулярной водородной связи между кислородом карбоксильной группы и водородом аминогруппы. Разрыв этой связи приводит к существенным изменениям пространственных характеристик вещества [5]. Био- логическая активность лекарственных веществ, действующих по принципу межмолекулярного взаимодействия с биологическими мишенями, реализуется двумя основными механизмами:

• 1)    образованием прочных водородных связей между полярными группами лиганда и мишени;

• 2)    гидрофобным эффектом при наличии в молекулах гидрофобных сегментов.

В связи с этим большинство эффективных и высокоселективных лекарственных веществ, являющихся сложными органическими соединениями, в своих молекулах содержат необходимый набор полярных групп, способных образовывать в водной среде прочные водородные связи с белками и гидрофобный сегмент. Гидрофобные участки молекул повышают селективность лигандов и дополнительно к полярным группам увеличивают прочность комплекса лиганд-мишень за счет энергии гидрофобного эффекта. Цель работы: изучение зависимости между величиной гидрофобного сегмента молекулы фуросемида и его мочегонной активностью.

Материал и методы

Объектами исследования являлись диуретическое средство фуросемид, его производное йод-фуросемид и лабораторные крысы. Квантово-химические расчеты выполнялись неэмпирическим методом DFT B3LYP/6-31G** (d, p) с обменным функционалом Беке В3 и корреляционным функционалом Ли, Янга и Пара (LYP). Расчеты осуществлены с помощью программного комплекса PC GAMESS (Firefly), версия 7.1.С, разработанного под руководством проф. А.А. Грановского в лаборатории химической кибернетики МГУ и содержащего все основные вычислительные алгоритмы, необходимые для теоретического исследования химических систем [2, 3]. В качестве вычислительного ядра для квантово-химических расчетов применялся 30-узловой вычислительный кластер на базе ЭВМ IBM PC под управлением ОС ASPLinux 12.0. Геометрия молекулы фуросемида была полностью оптимизирована, отсутствие мнимых частот колебаний подтверждало ее стационарный характер.

Фармакологические исследования проведены в осенний период на крысах-самцах Wistar массой 220–250 г, которых содержали на стандартной диете в естественном световом режиме. Животные находились в индивидуальных клетках, приспособленных для сбора мочи. Подопытные крысы были разделены на 2 группы: I группа (n=12) – крысы, которым вводили фуросемид; животным II группы (n=12) вводили йод-фуросемид. После определения контрольных показателей в каждой группе всем животным однократно подкожно был введен 1 мл 0,9-процентного раствора хлорида натрия в качестве контрольного вещества. Собирали мочу за сутки, определяя величину диуреза, экскрецию ионов натрия и калия. На следующий день животным I группы ввели подкожно фуросемид в дозе 15 мкмоль/кг в 1 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия; крысам II группы – йод-фуросемид в эквимолярной дозе. Через сутки вновь определяли указанные параметры экскреторной функции почек. Ионы натрия и калия определяли методом плазменной фотометрии на фотометре ПАЖ-3. Исследования на животных проводили в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ МЗ СССР №75 от 12.08.1987 г.) и Федеральным законом РФ “О защите животных от жестокого обращения” от 01.01.1997 г. Результаты обрабатывали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента с определением среднего арифметического значения М и его стандартной ошибки m. Анализ данных выполнен с использованием программы Biostat для Windows.

Результаты

Проведены квантово-химические расчеты пространственной и электронной структуры фуросемида и йод-фуросемида. Полученные молекулярные модели фуросемида и йод-фуросемида представлены на рисунках 1 и 2, а сравнение пространственных и электронных характеристик этих соединений – в таблице 1.

Эффективные заряды практически не изменяются, за исключением атомов, связанных с атомом йода или находящихся в непосредственной близости от этого заме-

Рис. 1. Структура молекулы фуросемида, рассчитанная методом функционала плотности (DFT – B3LYP) в базисе 6–31G** (d, p)

Рис. 2. Структура молекулы йод-фуросемида, рассчитанная методом функционала плотности (DFT – B3LYP) в базисе 6–31G** (d, p)

Таблица 1

Эффективные заряды на атомах по Милликену

Фуросемид			Йод-фуросемид			Фуросемид			Йод-фуросемид
атом		заряд	атом		заряд	атом		заряд	атом		заряд
1	O	–0,521	1	O	–0,519	17	C	0,346	17	C	0,340
2	O	–0,519	2	O	–0,518	18	C	–0,102	18	C	–0,046
3	H	0,298	3	H	0,299	19	N	–0,640	19	N	–0,641
4	H	0,300	4	H	0,300	20	C	0,569	20	C	0,571
5	N	–0,711	5	N	–0,711	21	O	–0,529	21	O	–0,529
6	S	1,179	6	S	1,180	22	O	–0,479	22	O	–0,476
7	O	–0,441	7	O	–0,430	23	H	0,166	23	H	0,168
8	C	0,135	8	C	0,092	24	Cl	0,044	24	Cl	0,173
9	C	–0,136	9	C	–0,102	25	H	0,116	25	H	0,117
10	C	–0,136	10	C	–0,136	26	H	0,330	26	H	0,332
11	C	0,256	11	C	0,257	27	H	0,117	27	H	0,122
12	C	–0,050	12	C	–0,051	28	H	0,104	28	H	0,113
13	C	0,027	13	C	0,032	29	H	0,103	29	H	0,140
14	C	–0,108	14	C	–0,115	30	H	0,135	30	H	0,134
15	C	–0,170	15	C	–0,132	31	H	0,131	31	H	0,302
16	C	–0,118	16	C	–0,342	32	H	0,301	32	I	0,075

Таблица 2

Структурные параметры молекул

Фуросемид Йод-фуросемид ции (табл. 2). параметр значение параметр значение Основные геометричес- Двугранный угол C13-C17-C11-O7 –45,98 Двугранный угол C13-C17-C11-O7 –46,70 кие параметры, углы между Двугранный угол N19-C12-C11-O7 –60,16 Двугранный угол N19-C12-C11-O7 –60,39 плоскостями бензольного Двугранный угол H32-N19-C11-O7 –41,20 Двугранный угол H31-N19-C11-O7 –41,73 кольца и фуранового цикла, Двугранный угол C14-C15-S6-N5 4,04 Двугранный угол N5-S6-C15-C14 2,75 а также углы между плоско- Двугранный угол C17-C13-C20-O21 0,43 Двугранный угол C17-C13-C20-O21 0,62 стью кольца, карбоксиль- Водородная связь O21-H32 Межъядерное расстояние H32-O7 1,915 2,613 Водородная связь O21-H31 Межъядерное расстояние H31-O7 1,911 2,626 ной и сульфаниламидной Межъядерное расстояние O21-H26 0,972 Межъядерное расстояние O21-H26 0,972 группами практически Межъядерное расстояние N19-H32 1,010 Межъядерное расстояние N19-H31 1,010 идентичны в этих молеку- лах. В целом геометрия не

Рис. 3. Фармакологическая активность фуросемида и йод-фу-росемида стителя. Также практически не изменилось распределение зарядов на атомах карбоксильной и сульфаниламидной групп, способных образовывать водородные связи с субстратом и участвующих в специфической сольвата- претерпела существенных изменений, за исключением самого заместителя – йода, обладающего большим Ван-дер-Ваальсовым радиусом. Сравнительный анализ структур этих молекул показал, что их геометрические параметры практически одинаковы, а различия в длине связей незначительны. Распределение заряда на основных функциональных группах, участвующих в специфических взаимодействиях с белковым субстратом, также не претерпело существенных изменений. Это позволяет предположить, что основную роль в повышении биологической активности молекулы играет само наличие объемного заместителя – йода, в значительной степени увеличивающего гидрофобный эффект. Так, по литературным данным, введение йода приводит к увеличению ∆G гидрофобного эффекта для йод-бензола в сравнении с бензолом на 3,7 кДж/моль [4]. Теоретически это приводит к увеличению константы прочности комплекса с белковыми молекулами в 4,2 раза при температуре 310 К.

Результаты проведенных сравнительных фармакологических исследований диуретической и салуретической активности фуросемида и йод-фуросемида приведены на рисунке 3.

Представленные на рисунке 3 изменения основных показателей экскреторной функции почек выражены в процентах по отношению к контрольным значениям. Эквимолярная доза йод-фуросемида вызывала увеличение диуреза в 1,8 раза большее по сравнению с фуросемидом. Экскреция ионов натрия под влиянием йод-фу-росемида превысила эффекты фуросемида в 1,9 раза, а экскреция калия – в 1,8 раза.

Обсуждение

Для экспериментального подтверждения результатов квантово-химических расчетов нами было синтезировано производное фуросемида – йод-фуросемид. В полученном соединении во втором положении фуранового цикла фуросемида атом водорода был замещен на атом йода. Поскольку атом йода имеет значительно больший радиус, чем водород, и к тому же он неполярен, то полученное соединение должно было иметь существенно больший гидрофобный сегмент, чем исходный фуросемид. Проведенное экспериментальное исследование показало, что введение в молекулу фуросемида атома йода с целью увеличения площади гидрофобного сегмента фуранового цикла молекулы фуросемида повышает диуретическую и салуретическую активность препарата. Проведенное теоретическое исследование показало, что основные характеристики электронного строения фуросемида и йод-фуросемида не имеют существенных отличий, что также позволяет предполагать наличие у модифицированного соединения аналогичных фуросемиду фармакодинамических характеристик, однако с существенно большей активностью. Следует отметить, что атом йода не способен образовывать водородные связи, его роль заключается только в увеличении энергии гидрофобного эффекта.

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют о существенной роли гидрофобного сегмента в реализации мочегонного эффекта фуросемида. Повышение мочегонной активности препарата прямо пропорционально увеличению площади гидрофобного сегмента его структуры. Уве- личение площади гидрофобного сегмента фуросемида за счет введения атома йода не оказывает сколько-нибудь значимого влияния на электронное строение диуретика. Этот факт позволяет предположить наличие идентичного фуросемиду механизма мочегонной активности у вновь полученного соединения. Проведенное исследование показало потенциальную возможность создания новых мочегонных препаратов с более высокой активностью. Это позволит существенно снижать их терапевтическую дозу, что приведет к резкому уменьшению выраженности многочисленных побочных эффектов этой группы лекарственных средств. В случае с фуросемидом основным побочным эффектом является выраженная гипокалиемия, особенно при курсовом применении препарата.