К проблеме доклинического исследования современных многокомпонентных противотуберкулезных препаратов, содержащих и не содержащих витамин В6

Со времен Роберта Коха, открывшего 24 марта 1882 г. микобактерию туберкулеза (палочку Коха), был синтезирован целый ряд химических веществ, направленных на подавление метаболизма микобактерии и лизиса ее толстой клеточной оболочки, разработаны методики лечения, но, к сожалению, проблема туберкулеза все еще актуальна. В мире ежегодно от туберкулеза умирает 2-3 миллиона человек. В России это заболевание прочно и с большим отрывом заняло первое место среди всех инфекций и продолжает быстро распространяться [7], превышая аналогичные показатели в странах Европы в 5-8 раз. В течение последних 3 лет ежегодно заболевает около 117-120 тысяч российских граждан и умирает около 25 тысяч человек (по данным Всемирной организации здравоохранения). В 2008 г. показатель заболеваемости туберкулезом составил 85,0 на 100 тысяч населения.

Туберкулез определяет уровень социальноэкономической напряженности в обществе вне зависимости от того, какую группу населения используют для анализа заболеваемости. Негативные экономические изменения и социальноэкономические проблемы влияют на привычный уклад жизни большинства населения, провоцируя тем самым изменения иммунного статуса всех без исключения членов общества. Социально отягощенные лица являются одной из наиболее важных групп риска заболевания туберкулезом. К этой группе относятся прибывшие из учреждений УИН МЮ РФ, лица злоупотребляющие алкоголем, наркоманы, безработные, эмигранты, лица БОМЖ. Численность данных категорий больных постоянно увеличивается в связи с падением уровня жизни и притоком

Усов Константин Ильич, аспирант.   E-mail:

эмигрантов из стран СНГ [7]. Также некоторые авторы [2, 4] считают, что рост туберкулеза в России наблюдается на фоне тотальных прививок новорожденных, в роддомах (БЦЖ — против туберкулеза) так называемыми: «живыми» вакцинами, или их ослабленными модификациями. Согласно Российскому календарю профилактических прививок, прививку БЦЖ ставят ребенку в первые дни жизни, когда происходит только формирование иммунной системы [4].

Последнее время в современные, комбинированные, противотуберкулезные препараты стали включать витамин В6 как витаминный компонент, обладающий антидотными свойствами [3]. Для определения его роли в составе комбинированных форм нами было проведено сравнительное экспериментальное (доклиническое) исследование [6] 2 лекарственных форм: «Протуэтам В6», содержащий в своем составе: 300 мг изониазида, 800 мг этамбутола гидрохлорида и 20 мг пиридоксина гидрохлорида, и «Протубэтам», не содержащего пиридоксина гидрохлорида, по биохимическим показателям крови и мочи. Для доклинического изучения биохимических показателей был поставлен острый эксперимент на двух группах животных: 1-я группа: беспородные собаки (самцы, самки) [4]; 2-я группа: нелинейные белые крысы (самцы, самки). Собаки размещались в отдельных, специализированных боксах с подогреваемым полом, выгул осуществлялся в вольерах вивария. Один раз в день животные получали воду комнатной температуры в объеме 1,45 л. Корм один раз в день. Крысы содержались по 6 животных в клетке в стандартных условиях при температуре 20-22оС и естественном световом режиме на стандартном рационе вивария. Получали питьевую воду без ограничений. Критериями включения животных в эксперимент являлось ветеринарное заключение местной службы Госветнадзора, в ряде случаев заключение областной ветеринарной лаборатории на бактерионосительство. Динамику изучали по следующим выбранным биохимическим показателям: аланинаминотрансферазу (АлАТ), аспартатаминотрансферазу (АсАТ), общий белок, общий билирубин, холестерин, глюкозу, мочевину определяли в сыворотке крови, содержание ксантуреновой кислоты и наличие изониазида и его метаболитов — в моче животных. Для забора крови у крыс проводили эвтаназию путем декапитации, моча собиралась в обменные клетки Simax с соблюдением Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным.

В ходе эксперимента 1-й группе животных введение «Протубэтама» и «Протубэтама В6» производили однократно, перорально или дробно (в 3, 4 разовых подходах в течение 4-6 часов) с кусочками мяса в дозах: 140 мг/кг (токсическая), 70 мг/кг (промежуточная) и 10 мг/кг (терапевтическая). Изменения динамики биохимических показателей наблюдалось при дозе 140 мг/кг и частично 70 мг/кг. При введении «Протубэтама» было обнаружено небольшое повышение активности АлАт 276-284 ед/л самцы, 243-251ед/л самки при дозе 140 мг/кг и АсАТ на 1-7 сутки, увеличение количества общего белка 72-76 г/л, 70-73 г/л при дозе 140 мг/кг на 1-7 сутки. Изменение общего билирубина не отмечено. Аналитический сигнал был обнаружен при проведении качественной реакции на изониазид и его отсутствие характерное для ацетилированных форм изониазида во всех пробах. Ксантуреновая кислота как маркер измененного обмена триптофана была обнаружена только при токсической 1,30,4 мкг/мл, 0,7-0,1 мкг/мл и промежуточной дозе 0,8-0,1 мкг/мл, 0,1-0,3 мкг/мл на 1-14 сутки. Введение «Протубэтама В6» сопровождалось повышением активности АлАТ, на фоне динамического контроля 266-215 ед/л самцы — 258-204 ед/л самки с 1 по 14 сутки в дозе 140 мг/кг, 230192 ед/л — 241-188 ед/л в дозе 70 мг/кг. Аналогичное повышение активности было характерно и для АсАТ. Нами было не обнаружено при введении «Протубэтама» теоретически ожидаемого одновременного снижения АсАТ и АлАТ, характерного в ситуации недостаточности пиридоксина, так как пиридоксальфосфат является производным витамина В6, который катализирует перенос аминогруппы аланина на альфа-кетоглутаровую кислоту с образованием пировиноградной кислоты и глутаминовой кислоты. А как уже было доказано [5], переаминирование происходит только в присутствие кофермента — пиридоксальфосфата, поэтому одновременное снижение активности АсАТ и АлАТ считают диагностической тестовой пробой в ситуации снижения концентрации витамина В6. Теоретически снижение концентрации витамина происходит из-за быстрого выведения водорастворимого витамина и антагонистического отношения его с изониазидом. В результате проведенного нами эксперимента эффект был обратным, направленным в сторону повышения активности печеночных ферментов. При сравнении активности печеночных проб аминотрансфераз при введении лекарственных форм содержащих и не содержащих витамин В6 было не обнаружено четких различий в динамике, несмотря на тот факт, что в состав «Протубэтама В6» входит 20 мг витамина В6. Данное предположение, наталкивает на вопрос о целесообразности включения в «Проту-бэтам В6» витамина В6.

Так же было отмечено некоторое повышение количества общего белка — 74-78 г/л самцы, 7577 г/л самки при дозе 140 мг/кг и общего билирубина — 10-12 ммоль/л самцы, самки при дозе 140 мг/кг. Величины содержания ксантуреновой кислоты были крайне неустойчивы. Группа с введением терапевтической дозы от контроля не отличалась. В моче 1-й группы животных не удалось выявить ацетилированных продуктов изониазида, хотя сам изониазид качественной реакцией определялся.

При однократном внутрижелудочном введении 2-й группе животных, в дозах: 140 мг/кг (токсичная), 70 мг/кг (промежуточная), 10 мг/кг (терапевтическая) «Протубэтама» и «Протубэта-ма В₆» в виде водной суспензии с помощью металлического зонда с атравматичным наконечником определение показателей вели на 1, 3, 7, 14, 21 сутки на фоне динамического контроля. Это позволило обнаружить при введении «Протубэ-там» в остром эксперименте, повышение активности АлАТ для токсической дозы 101,4 + 7,8 -120,5 + 8,3 ед/л самцы, а у самок наблюдался незначительный эффект повышения 98,2 + 6,7 -99,6 + 7,1 на 1-3 сутки, самцы - самки, с 7-21 сутки, при р < 0,05. Идентичный, но менее выраженный эффект был зафиксирован при дозе 70 мг/кг. Аналогичная динамика была характерна для АсАТ. Также наблюдалось повышение уровня мочевины 8,1 + 0,05 - 8,7 + 0,06 ммоль/л и 8,2 + 0,05 - 8,6 + 0,07 ммоль/л, глюкозы 5,66 + 0,06 -7,2 + 0,08 ммоль/л и 5,64 + 0,07 - 6,91 + 0,07 ммоль/л на 7 сутки при дозе 140 мг/кг, на 14 и 21 сутки показатель от контроля не отличался. С 1-3 сутки при дозе 140 мг/кг повышалось количество общего белка 94,2 + 1,9 - 95,4 + 1,8 г/л и 92,8 + 4,3 -93,2 + 2,8 г/л, при дозе 70 мг/кг — тенденции в сторону понижения. Количество билирубина несколько повышалось к 14 суткам при дозе 140 мг/кг 8,2 + 0,09 - 9,2 + 0,1 ммоль/л и 8,2 + 0,09 -9,0 ± 0,2 ммоль/л. При дозах 140 мг/кг и 70 мг/кг на 3-14 сутки после введения в моче животных была обнаружена ксантуреновая кислоты 9,1 ± 1,6 - 0,96 + 0,7 мкг/мл и 8,6 ± 2,4 - 0,28 + 0,2 мкг/мл. Доза 10 мг/кг существенного отличия показателей от контрольного уровня не вызвала, как и отличий между самцами и самками.

При однократном ведении «Протубэтама В6» наблюдалось повышение активности АлАТ в сыворотке крови на 1-3 сутки при дозах 140 мг/кг составило 93,6+6,5 - 101,2+8,3 ед/л и 96,6+4,9 -117,2+6,7 ед/л, 70 мг/кг — 81,1+3,6 - 84,8+5,0 ед/л и 84,3+5,0 - 88,1+6,7 ед/л, а затем наблюдался спад активности, что было характерно и при введении «Протубэтама». Динамика активности АсАТ была направлена в сторону повышения. На 7-е сутки при дозе 140 мг/кг было установлено повышение уровня мочевины 8,6±0,07 и 8,7±0,07 ммоль/л, общего белка 87,4±0,9 и 85,2±1,4 г/л, глюкозы 7,0±0,08 и 6,88±0,07 ммоль/л, на 14 и 21 сутки показатель не отличался от фона динамического контроля, при дозе 70 мг/кг была характерна аналогичная тенденция. Количество билирубина несколько повышалось к 14 суткам при токсической дозе 9,4±0,1 и 9,1±0,1 ммоль/л. Введение дозы 140 мг/кг на 1-7 сутки вызвало появление ксантуре-новой кислоты в концентрации 3,4±2,0 - 0,5±0,3 мкг/мл и 1,6±0,7 - 0,1±0,09 мкг/мл, а при 70 мг/кг кислота была идентифицирована только на 1 сутки — 0,9±0,4 и 0,5±0,1 мкг/мл. Качественная реакция на изониазид и его метаболизированные формы во всех пробах была положительной.

Выводы: отмечены биохимические сдвиги в активности печеночных ферментов при введении токсической и промежуточной дозы, что является признаком белково-жировой дистрофии печени [1]. Общая направленность изменений при однократном введении «Протубэтама» и «Протубэтама В6» оставалась по существу одинаковой. Полученные биохимические сдвиги показателей при введении токсической и промежуточной доз были также подтверждены гистохимическими и морфологическими данными, в частности выраженной белковой дистрофией гепатоцитов в области портального тракта, просветлением цитоплазмы перинуклеарных зон и некоторым снижением гликогена в печени. Не было получено ожидаемого токсического действия изониазида при введении терапевтической дозы, хотя исследование на собаках показали большую чувствительность этого вида животных к препарату, но, по-видимому, связанную с замедлением метаболизма изониазида и с задержкой его в крови из-за не выраженности процессов ацетилирования у собак [3].