К вопросу характеристики пленкообразных структур, получаемых в процессе биоконверсии отходов птицеперерабатывающей отрасли

Среди отходов птицеперерабатывающей отрасли значительные объемы составляет яичная скорлупа. Поскольку она формируется в живом организме, ее в полной мере можно отнести к сырью биогенного происхождения. Главным компонентом яичной скорлупы является кальций. Его можно перевести в растворимое состояние, обрабатывая скорлупу растворами кислот. При изучении биоконверсии яичной скорлупы в высококислотной биологической жидкости [1] обнаружено появление пленкообразных структур (ПС). При этом было отмечено, что их формирование наблюдалось в случае внесения цельной скорлупы (лома). По внешнему виду ПС напоминали подскорлупную оболочку (ПО), которую при подготовке яичной скорлупы к биодеградации, по возможности, тщательно удаляли.

Данная работа посвящена изучению ПС, получаемых в процессе биоконверсии яичной скорлупы, и установлению химической природы соединений, ее формирующих. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• •    провести микроскопические исследования поверхностей ПС и ПО;

• •    исследовать гистохимические препараты ПС и ПО;

• •    провести сравнительный анализ полученных результатов.

Материалы, объекты и методы исследования . В работе использовались следующие материалы:

• •    скорлупа от куриных яиц с удаленной ПО в цельном (лом) и измельченном (размер частиц не более 1 мм ²) виде;

• •    обезжиренное молоко кислотностью не более 19⁰ Т, полученное из молока не ниже 1 сорта по ГОСТ 52054-2003;

• •    молочная сыворотка, полученная при производстве творога с титруемой кислотностью 55±5⁰Т, пастеризованная перед применением;

• •    монокультура Lactobacterium acidophilum 20Т, приобретенная во ВНИИМП;

• •    ассоциация микроорганизмов, полученная на основании патента [2];

• •    природная ассоциация микроорганизмов – «Тибетский гриб» [3].

Объектами изучения являлись системы: “ферментированное обезжиренное молоко: яичная скорлупа”, “ферментированная молочная сыворотка : яичная скорлупа”, “растворы молочной кислоты : яичная скорлупа”, “растворы уксусной кислоты : яичная скорлупа”, ПО, ПС. В работе использовали общепринятые микробиологические [4], биохимические[5] и гистохимические[6,7] методы исследования. Изображения поверхности ПС и ПО получали на растровом электронном микроскопе JEOL-JSM-651OLV в лаборатории электронной микроскопии и рентгеноспектрального микроанализа Центра Коллективного Пользования «Прогресс» ВСГТУ. При использовании гистохимических методов для изучения структуры и химического состава ПС и ПО, в зависимости от используемых методик, фиксацию проводили спиртом или формалином. Проводили цветные гистохимические реакции на следующие полимеры: гликоген, коллаген, липиды и мукополисахариды. В качестве контроля использовали нативную ПО. Фотографии гистохимических препаратов получали с помощью оптического микроскопа Биолам ЛОМО Р11 и цифровой фотокамеры Levenhuk C510.

Результаты и их обсуждение. Формирование скорлупы в организме кур происходит на последнем этапе образования цельного яйца. В скорлупе различают 2 слоя, так называемые сосочковый и губчатый. Между сосочковым слоем и подскорлупной оболочкой формируются фибриллярные нити, которые осуществляют прочную связь между этими структурами. Образование ПС на внутренней поверхности яичной скорлупы при внесении ее в ферментированное культурами микроорганизмов обезжиренное молоко возможно по одной из следующих причин:

• •    синтез ПС культурой микроорганизмов;

• •    отслаивание пронизывающего скорлупу тончайшего слоя подскорлупной оболочки в процессе вымывания из нее минеральной части;

• •    деление клеток животного происхождения, находящихся в скорлупе или подскорлупной оболочке;

• •    самосборка ПС на поверхности яичной скорлупы, выступающей в качестве матрицы.

В научной литературе имеется множество сведений о способностях микроорганизмов различных таксономических групп синтезировать экзогенно вещества, представляющие собой полимеры. Некоторые виды уксуснокислых бактерий (к примеру, Acetobacter xylinum) способны образовывать внеклеточную слизистую пленку, состоящую из целлюлозы [8]. Целлюлозные фибриллы образуют рыхлую массу, обволакивающую клетки бактерий. Эта способность ярко проявляется и в ассоциациях. Одна или несколько групп микроорганизмов выделяют слизь, называемую «зооглея» (zoogloea), в которую включаются клетки других микроорганизмов ассоциации [3,9]. Образование «зооглея» носит приспособительный характер, так как благодаря его вязкой консистенции легко осуществляется адсорбция не только клеток, но также и питательных веществ из окружающей среды. В качестве примера можно привести такие ассоциации, как чайный гриб, молочный тибетский гриб, морской индийский рис и т.п. По оценкам специалистов, «зооглея» состоит из полисахаридов и азотистых веществ[3,9].

В эксперименте ПС образовывались в присутствии яичной скорлупы с удаленной подскорлупной оболочкой при определенных условиях ферментации обезжиренного молока ассоциацией микроорганизмов с кислотностью 300±400Т [2]. Формирование ПС на поверхности скорлупы наблюдалось и при ферментации (в тех же условиях) обезжиренного молока монокультурой Lactobacterium acidophilum, входящей в состав данной ассоциации. Пределом кислотообразования в молоке монокультурой L. аci-dophilum является 300 0Т [10], что в пересчете на концентрацию молочной кислоты в системе составляет 2,7±0,1%.

Тибетский гриб также способен синтезировать значительные количества кислоты, которая растворяет минеральную часть скорлупы. Культивирование тибетского гриба на обезжиренном молоке в присутствии яичной скорлупы также способствовало получению ПС. Поскольку образование ПС на поверхности скорлупы происходило независимо от микробиологического состава изучаемой системы, дальнейшие исследования проводили в условиях, исключающих жизнедеятельность микроорганизмов.

С целью инактивации жизнедеятельности микроорганизмов ферментированные среды перед внесением яичной скорлупы подвергали термической обработке. При этом замена обезжиренного молока на молочную сыворотку позволила исключить влияние основного белка молока - казеина на формирование ПС. На ферментированной разными микроорганизмами сыворотке, термически обработанной, имело место образование фрагментов ПС (табл.1). Следовательно, образование ПС не является результатом микробиологического синтеза. Далее проведена апробация возможности роста ПС на модельных системах. В качестве источников углерода выбраны продукты жизнедеятельности используемых культур микроорганизмов – молочная и уксусная кислоты, для азотного питания введен аспарагин. Во всех случаях получали ПС. Даже при экспонировании измельченной скорлупы в ферментированной L. acidophilus молочной сыворотке выявлено наличие тонких ПС, формирующихся в культуральной жидкости (КЖ). Только две экспозиции- “цельная скорлупа : раствор натрия двууглекислого” (рН=8), “цельная скорлупа: вода дистиллированная” (рН=7) давали отрицательный результат относительно образования ПС. В таблице 1 представлены результаты эксперимента по влиянию состава питательных сред на образование ПС.

Таблица 1

Влияние состава питательных сред на образование ПС

№ пробы	Питательная среда	Наблюдения	Наличие ПС
1	10% раствор уксусной кислоты + 0,1% аспарагина	Растворение минеральной части скорлупы, наличие на дне емкости ПС белого цвета	++
2	10% раствор молочной кислоты + 0,1% аспарагина	Частичное растворение минеральной части скорлупы, формирование на остатках скорлупы ПС цвета КЖ	++
3	Сыворотка ферментированная Lactobacterium acidophilus, термически обработанная	Частичное растворение скорлупы, ПС (рыхлая) на поверхности КЖ, ПС внутри нерастворенной скорлупы	+
4	Сыворотка ферментированная тибетским грибом, термически обработанная	Частичное растворение скорлупы, ПС (рыхлая) на поверхности КЖ, ПС внутри нерастворенной скорлупы	+
5	Сыворотка ферментированная Lactobacterium acidophilus	Частичное растворение минеральной части скорлупы, ПС (рыхлая) на поверхности КЖ	++
6	Сыворотка ферментированная тибетским грибом	Частичное растворение минеральной части скорлупы, ПС (отдельные фрагменты) в толще КЖ, ПС (рыхлая) на поверхности КЖ	++
7	1,5%раствор молочной кислоты	Наличие нерастворенной скорлупы с ПС цвета КЖ на внутренней поверхности	++
8	Фосфатно–цитратный буфер рН=6	Частичное растворение минеральной части скорлупы ПС внутри КЖ	++
9	Контроль: раствор натрия двууглекислого (рН=8)	Без изменений	-
10	Контроль: вода дистиллированная (рН=7)	Без изменений	-

Обозначения: “+”-наличие отдельных фрагментов ПС; “++”- ПС в виде сплошной пленки; “-“ - отсутствие ПС на поверхности скорлупы и в КЖ

По окончании эксперимента ПС отмывали от питательной среды и высушивали при комнатной температуре. Сканирование поверхности образцов на растровом электронном микроскопе позволило выявить у всех полученных ПС нити, подобные фибриллам. Снимки поверхностей ПС (х1000), полученных на питательных средах различного состава, представлены на рисунке 1.

Сравнительный анализ изображений опытных образцов и изображений нативной ПО позволяет прийти к выводу об их идентичности. Исследуемые ПС, в отличие от нативных ПО, имеют значительное количество включений (структурных образований), напоминающих встроенные в фибриллярную сеть клетки. Возможно, в силу рыхлости структуры ПС наблюдается их лучшая экранизация. Анализ результатов эксперимента дает основание предположить, что при удалении ПО с поверхности скорлупы остаются фибриллярные нити, соединяющие ПО с ее сосочковым и губчатым слоями. Попадая в кислую среду, минеральные вещества растворяются, а вышеупомянутые слои остаются. Однако заметное утолщение и ресинтез ПС при близких к нейтральному значениях рН (проба №8), когда процесс растворения минеральной части скорлупы практически отсутствует, позволяет сделать предположение о несколько других механизмах образования ПС, чем простое вымывание минеральных компонентов из оставшихся слоев ПО.

б

BES 20kV WD14mm SS78 77Pa x1,000  —       10pm

ESSTU_______________Sample____________________0000     01 Apr 2010

а

г

в

д

Рис.1. Изображение поверхности пленкообразных структур (ПС), полученных на растровом электронном микроскопе JEOL-JSM-651OLV (×1000): а- проба №2; б-№3; в-№4; г-№5; д- №6 (номера проб соответствуют номерам образцов, представленных в табл.1);

е- образец нативной подскорлупной оболочки

е

Проведена гистохимическая окраска ПС и ПО. При просмотре гистохимических препаратов ПС и ПО, окрашенных любым из используемых методов, также как при электронном микроскопировании, обнаружена упорядоченная структура в виде нитей, расположенных сетчатообразно. Выявлены включения неправильной формы (структурные образования), которые были также более выражены на препаратах ПС. Результаты окрашивания препаратов ПС и ПО представлены в таблице 2, фотографии (×900)-на рисунке 2.

I                                                         II

Рис. 2. Фотографии гистохимических препаратов, окрашенных шифф-йодной кислотой-ШИК-реакция (×900): I-ПО; II-ПС.

Выявление химической природы пленкообразных структур гистохимическими методами

№	Реакция	Соединения, структуры	Типичная окраска	ПС		ПО
				Окраска    на препарате	Налич. со-ед.	Окраска на препарате	Налич. со-ед.
1.	Реакция шифф-йодная кислота (ШИК)	гликоген	Темнопурпурная, темно-вишневая	Коричневые волокна, включения грязнобордовые	-	Светлокоричневые волокна	-*[12]
2.	Окраска судаком III	липиды	Интенсивно оранжевая	Коричневый цвет волокон, включения-интенсивнокрасные	±	Не окрашивали	Нет данных
3.	Метод ван Гизона	Коллаген	Ярко-красная	Буроватокрасный цвет нитей (неравномерный), включения окрашены темнее, неравномерно	±	Не окрашивали	+*[11]
		Мышечные и эластические волокна	Буровато-красная или желтозеленая		±		+*[11]
		ядра клеток	темно-синие или темно-красные		-		Нет данных
4.	Реакция с аль-циановым синим (по Стид-мену)	Кислые мукополисахариды	Сине-зеленая	Неравномернобордовая окраска волокон, темнобордовая включений	-	волокна светло бордовые	+*[12]
5.		ядра клеток	Темно-синяя или темно-красная		±	не выявлены	Нет данных

Обозначения: “±” - недостаточно специфическое окрашивание;

“+” - наличие выявляемого соединения;

“-“ - отсутствие выявляемого соединения(структуры);

*-из литературных источников.

Результаты идентификации соединений, лежащих в основе ПС, гистохимическими методами свидетельствуют об отсутствии в их составе гликогена, полисахаридов соединительной ткани - мукополисахаридов. В отношении липидов нельзя сказать однозначно. Наличие в составе ПС коллагена и кератина точно не установлено. По типу волокон, обнаруженных в ПС, их можно отнести к эластическим.

Известно, что ПО в своем составе содержит белок [11]. Однако нет единого мнения о ее строении - некоторые исследователи относят ее к кератиновой, другие - к овокератиновой (белок с пониженным содержанием цистеина), есть мнение о ней как о коллагеновой, а также о белковой части подобной белку хрящевой ткани. С полной уверенностью относительно белковой части можно сказать только то, что она состоит из структурных белков. В научной литературе приводится следующий химический состав ПО: 80% сухих веществ, из них доля органических соединений - 87,5%, минеральных - 12,5%. В состав органического вещества входят галактозамин, глюкозамин, сиаловые кислоты, глюкоза, манноза, фукоза, сульфатированные мукополисахариды, гликопротеины. [12]. Известно, что комплексы протеогликановой природы представляют собой поливалентные анионы, способные связывать катионы, в том числе кальция [13].

Были проведены предварительные исследования химических свойств ПС, сравнительный анализ которых с ПО представлен в таблице 3.

Отмечено, что нативная ПО обладает высокой эластичностью при растирании, резании, устойчивостью к замораживанию, кислотному гидролизу, растворяется только при значениях рН=9^12, после высушивания становится хрупкой. Получаемые ПС также после высушивания становятся хрупкими, проявляют устойчивость к действию кислот, растворяются в растворах сильных щелочей.

Результаты проведенных исследований позволяют сделать следующие выводы:

• •    образование пленкообразных структур (ПС) на внутренней поверхности скорлупы куриных яиц в высококислотных биологических жидкостях не является результатом микробиологического синтеза;

Растворимость пленкообразных структур (ПС) и подскорлупных оболочек (ПО)

	Реагенты	растворимость
		ПС	ПО
1.	Вода дистиллированная, водопроводная	-	-
2.	HCl, HNO 3 ,H 2 SO 4 (4%-ные растворы)	-	-
3.	HCl, HNO 3 , H 2 SO 4 (конц.)	-	-
4.	NаOН,КОН (4%-ные растворы)	-	-
5.	NаOН,КОН (10%-ные растворы)	+	+
6.	NаOН,КОН (33%-ные растворы)	+	+
7.	Спирт этиловый (96%)	-	-

Обозначения: “-” – не растворяется; “+”- растворяется.

• •    образование ПС происходит в питательных средах различного состава при рН≤6;

• •    морфологическая картина поверхности пленкообразных структур ПС сходна с таковой под-скорлупной оболочки (ПО) куриных яиц и содержит нити, напоминающие фибриллы белков соединительной ткани, о чем свидетельствуют гистохимические и микроскопические исследования;

• •    в составе пленкообразных структур (ПС) отсутствует гликоген;

• •    ПС и ПО имеют ряд сходных физико-химических свойств (растворимость при значениях рН=9÷12, устойчивость к замораживанию и т.д.);

• •    микроскопическая картина ПС отличается от ПО наличием структурных образований.