К вопросу о действии оксилипинов на прорастание семян гороха Pisum sativum L

На ранних стадиях прорастания при активации липоксигеназ в тканях семян происходит интенсивная экспрессия генов, контролирующих эти процессы (8). Наличие среди продуктов окисления липоксигеназ биорегуляторов, контролирующих специфические этапы биосинтеза, может свидетельствовать о нарушении гормонального равновесия. Фосфорилирование полипептидов отдельных фракций в этот период связывают с действием липоксигеназ (9). Предполагается, что активирование оксилипинами протеинкиназ при прорастании семян сопровождается повышением активности гидролитических ферментов, накопление которых происходит в результате расщепления мембранных комплексов и перехода ферментов в свободное активное состояние, а также образования новых ферментов в алейроновом слое и зародыше (10). При этом оба процесса контролируются гормонами и другими регуляторами, в том числе, вероятно, и оксилипинами.

Задача нашей работы состояла в определении действия оксилипинов на прорастание семян гороха ( Pisum sativum L.) и активность амилолитического комплекса с целью выявления соединений, способствующих изменению субстратного обеспечения глюкозой процессов дыхания.

Методика. Объектом исследования служили семена гороха сорта Татарстан (Татарский НИИ сельского хозяйства), которые обрабатывали 0,05 % раствором марганцевокислого калия в течение 30 мин, а затем помещали в чашки Петри (по 50 шт.) и проращивали в следующих растворах: 12-ГДК, МЖ и этеролевая кислота (ЭК) — (9 Z, 11 Е ,1' Е ,3' Z ) -12-(1',3 '-гексадиенилокси)-9,11 -додекадиеновая кислота; концентрация оксилипинов составляла 10^-9 и 10^-6 М. Чашки выдерживали в термостате при 23 ^оС в течение 20 ч до проклевывания семян; доращивание проводили в дистиллированной воде (11). Продолжительность опытов составляла 3 сут (начиная с 20 ч — оптимальное время для оценки проклевывания семян). Аналитическая и биологическая повторность опыта 3-кратная. В контроле использовали дистиллированную воду.

(Р = 0,05) (13).

Результаты. Увеличение липоксигеназной активности в процессе развития зародыша предполагает регуляцию оксилипинами выхода семян из состояния покоя (8). По данным наших исследований, 12-ГДК и МЖ оказывали влияние на начало проклевывания семян гороха после замачивания. При этом рН всех исходных растворов после проращивания в них семян практически не изменялся (табл.).

Реакция среды (рН) проращивания семян гороха сорта Татарстан под влиянием оксилипинов

Вариант опыта (концентрация раствора) рН исходного раствора рН среды инкубации Контроль 6,3 6,1±0,06 МЖ (10–9 М) 6,2 6,0±0,06 МЖ (10–6 М) 6,2 5,9±0,02 12-ГДК (10–9 М) 6,4 6,3±0,05 12-ГДК (10–6 М) 6,5 6,4±0,04 ЭК (10–9 М) 6,5 6,3±0,04 ЭК (10–6 М) 6,5 6,5±0,02 П р и м е ч а н и е. МЖ — метилжасмонат,    12-ГДК — 9(Z)-12-гидрокси-9-додеценовая кислота, кислота. ЭК — этеролевая концентрации. При использовании МЖ (10–6

При концентрации МЖ 10–9 М наблюдалась как незначительная стимуляция прорастания (1-е сут), так и практическое (2-е сут) или полное отсутствие различий с контролем (3-и сут). При концентрации 12-ГДК 10–9 М на 1-е сут также выявлена незначительная стимуляция прорастания семян, скорость которого оказалась в 2 раза больше, чем в растворе МЖ (рис. 1, А и Б). Однако в конце 2- и 3-х сут доля проросших семян в опыте была ниже, чем в контроле. В 1-е сут оба вещества стимулировали прорастание семян как при высокой, так и при низкой М) различий между контролем и опы- том на 2-е сут не выявлено; на 3-и сут доля проросших семян в опыте снижалась. При низкой концентрации 12-ГДК доля проросших семян на протяжении всего эксперимента была аналогична таковой при высокой концентрации МЖ, и наоборот.

Этеролевая кислота практически не оказывала влияния на прорастание семян на протяжении 3 сут (исключение составляла концентрация 10–6 М) (см. рис. 1В). Незначительное и в основном статистически недостоверное воздействие ЭК могло быть связано с возрастом семян.

Различная степень прорастания семян при воздействии оксилипинов свидетельствует о широком диапазоне активности (как стимуляция, так и блокирование) регуляторов эндогенных фитогормонов; при этом не исключается нулевой эффект. Известно, что активность амилаз, расщепляющих крахмал до глюкозы, контролируется гибберелловой кислотой. Вместе с тем клетки алейронового слоя чувствительны ко многим фитогормонам, которые как раздельно, так и в сочетании с другими гормонами, регулируют ход синтеза и активность гидролитических ферментов. В регуляции этих процессов также возможно участие оксилипинов. При этом прорастание задерживается, если в семенах не образуется глюкоза (14). По-видимому, одним из механизмов стимуля- ции дыхания является повышение активности амилаз, приводящее к ускоренному прорастанию семени.

Время прорастания семя и, ч

Рис. 1. Доля проросших семян гороха сорта Татарстан (%) под влиянием 9( Z -12-гидрокси-9-додеценовой кислоты (А) , метилжасмоната (Б) и этеролевой кислоты (В) в различной концентрации: а и б — концентрация раствора соответственно 10^–9 и 10^–6 М; К — контроль (дистиллированная вода).

В нашем эксперименте при спектрофотометрическом определении негидролизованного амилазами остаточного крахмала не было выявлено полной зависимости амилазной активности от скорости прорастания семян под влиянием оксилипинов (см. рис. 1 и 2). Так, в течение первых суток не наблюдалось воздействия МЖ на активность амилаз (доля проросших семян при обеих концентрациях была выше, чем в контроле); на 2-е сут амилазная активность повышалась на 131 и 123 % при концентрации соответственно 10–9 и 10–6 М (см. рис. 1Б и 2а). Повышенная скорость прорастания семян через 24 ч после воздействия МЖ может быть связана со стимулирующим влиянием последнего на экспрессию липоксигеназных генов, активность которых максимально возрастает через 1 сут прораста-ния (15). По данным Voros с соавт., воздействие экзогенного МЖ вызывает кратковременную экспрессию липоксигеназного гена (максимальный эффект наблюдался через 12-18 ч) (16). При использовании 12-

Концентрация оксилипинов, М

Рис. 2. Амилазная активность (% от контроля) прорастающих семян гороха сорта Татарстан под влиянием метилжасмоната (а) , 9( Z -12-гидрокси-9-додеценовой (б) и этеролевой кислот (в) в различной концентрации по времени прорастания: 1, 2 — соответственно через 1 и 2 сут; I и II — — концентрация раствора сответственно 10^–9 и 10^–6 М; К — контроль (дистиллированная вода).

ГДК (10–6 М) амилазная активность возрастала через 1 и 2 сут после замачивания 101

семян соответственно на 206 и 15 % по сравнению с контролем (см. рис. 2б). Значительная стимуляция амилазной активности на 1-е сут способствовала ускорению прорастания семян на протяжении всего эксперимента (см. рис. 1А). Незначительное повышение скорости прорастания семян при действии 12-ГДК в высокой концентрации в течение 2 сут могло быть обусловлено как прямым, так и опосредованным влиянием оксилипина, в результате стимуляции фосфорилирования некоторых полипептидов (в частности амилаз), приводящей к увеличению активности последних. Кроме того, скорость прорастания могла возрастать в связи с синтезом в зародышах гиббереллина, под контролем которого находится синтез амилаз в наружных слоях эндосперма (16). Активность амилаз под воздействием 12-ГДК (10–9 М) повышалась через 1 и 2 сут соответственно на 18 и 7 %. По-видимому, позитивное влияние этого оксилипина на субстратное обеспечение дыхания происходило только на ранних этапах развития семени.

Воздействие ЭК на активность амилаз существенно отличалось от такового МЖ и 12-ГДК (см. рис. 1 и 2). Несмотря на отсутствие влияния ЭК на скорость прорастания семян, наблюдалось значительное снижение амилазной активности как через 1, так и 2 сут, за исключением варианта с концентрацией ЭК 10–6 М, в котором активность амилазы была на 16 % выше, чем в контроле (через 1 сут). Следовательно, при использовании ЭК наблюдалось отсутствие корреляции между амилазной активностью и скоростью прорастания семян.

Таким образом, повышенная степень прорастания семян гороха через 1 сут после воздействия 9( Z )-12-гидрокси-9-додеценовой кислоты и метилжасмоната может быть связана с влиянием этих оксилипинов на скорость поступления в семена воды, определяющей развитие на первых этапах онтогенеза (4). Этот процесс сопряжен с активацией в покоящихся семенах ферментов, в том числе амилолитических и липоксигеназных. Не исключено, что отсутствие влияния этеролевой кислоты на этапе проклевывания в определенной мере связано с затрудненным поступлением в семена воды из-за жесткости стареющей семенной кожуры.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.   Т а р ч е в с к и й И.А. Метаболизм растений при стрессе. Казань, 2001.

• 2.   G r e c h k i n A.N. Recent developments in biochemistry of the plant lipoxygenase pathway. Progr. Lipid

  Res., 1998, 37: 317-352.

• 3.   B l e e E. Phytooxylipins and plant defense reactions. Prog. Lipid Res., 1998, 37, 1: 33-72.

• 4.   О б р у ч е в а Н.В., А н т и п о в а О.В. Физиология инициации прорастания семян. Физиол. раст.,

  1997, 2: 287-302.

• 5.   И в а н о в а А.Б., Я р и н А.Ю., А н ц ы г и н а Л.Л. и др. Влияние 12-гидрокси-9( Z )-додеценовой

  кислоты на рост и деление клеток корней гороха. Цитология, 2001, 43, 2: 166-171.

• 6.   И в а н о в а А.Б., Я р и н А.Ю., А н ц ы г и н а Л.Л. и др. Влияние метилжасмоната на ростовые

  процессы у гороха. Цитология, 2002, 44, 4: 369-373.

• 7.    И в а н о в а А.Б., Я р и н А.Ю., А н ц ы г и н а Л.Л. и др. 12-гидрокси-9( Z )-додеценовая кислота — индуктор потребления кислорода и изменения рН внеклеточной среды отсеченными корнями пшеницы. Докл. РАН, 2001, 379, 6: 842-844.

• 8.    F e u s s n e r I., H a u s e В., N e l l e n A. e.a. Lipid — body lipoxygenase is expressed in cotyledons during germination prior to other lipoxygenase forms. Planta, 1996, 198: 288-293.

• 9.    К а р и м о в а Ф.Г., Т а р ч е в с к и й И.А., М у р с а л и м о в а Н.У. и др. Влияние продукта липоксигеназного метаболизма — 12-гидроксидодеценовой кислоты на фосфорилирование белков растений. Физиол. раст., 1999, 46: 148-152.

• 10.  Г р и н Н., С т а у т У., Т е й л о р Д. Биология. М., 1990.

• 11.  B e w l e y J.D. Protein and nucleic acid synthesis during seed germination and early seedling growth. In:

• 12.    Т р е т ь я к о в Н.Н. Практикум по физиологии растений. М., 1982.

• 13.    В о з н е с е н с к и й В.Л. Первичная обработка экспериментальных данных. Л., 1969.

• 14.  О в ч а р о в К.Е. Физиология формирования и прорастания семян. М., 1976.

• 15.  F e u s s n e r I., B a c h m a n n A., H o h n e М. e.a. All three acyl moieties of trilinolein are efficiently

  oxygenated by recombinant His-tagged lipid body lipoxygenase in vitro. FEBS Lett., 1998, 431: 433-436.

• 16.    V o r o s К., F e u s s n e r I., K u h n H. e.a. Characterization of a methyljasmonate - inducible lipoxygenase from barley ( Hordeum vulgare cv. Salome) leaves. Eur. J. Biochem., 1998, 251: 36-44.

Encyclopedia of plant physiol. New Ser. N. Y., 1982, 149: 559-591.

Институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, 420111, Казань, ул. Лобачевского, 2/31, а/я 30