К вопросу о фиксации ткане-инженерных конструкций на поверхности гиалинового хряща

Повреждение гиалинового хряща является актуальной проблемой для миллионов пациентов. Существующая консервативная терапия не полностью решает данную задачу, а эндопротезирование крупных суставов является сложной высокоинвазивной дорогостоящей процедурой.

Одной из перспективных технологий представляется метод тканевой инженерии (ТИ), который является динамично развивающимся направлением науки [1]. Этот метод особенно актуален в травматологии и ортопедии, поскольку в этой области медицины на первое место выходят биофизические параметры трансплантированного объекта, и только во вторую очередь – характеристики его клеточной составляющей [2].

Для внедрения данной методики в клиническую практику необходима серия экспериментов по трансплантации и фиксации продукта ТИ в области повреждения с целью анализа эффективности его применения у экспериментальных животных в течение длительного времени.

Целью этой работы являлась оценка фиксации ткане-инженерной конструкции на основе полилактида (PLA) в дефектах гиалинового хряща.

Материалы и методы исследования

Приготовление биодеградируемого носителя. При изготовлении полимера в качестве основы использовали поли-L-лактид-полимер вязкостью 4.0 дл/г (Sigma, США). Полимер растворяли в диоксане («Реактив», Россия) до конечной концентрации 5 %. В этот раствор при перемешивании добавляли 5 % раствора коллагена концентрацией 0,1 мг/мл. Полученную суспензию замораживали при температуре –20 °С на 24 часа. После заморозки полученного полимера, его высушивали в лиофилизаторе при давлении 1 Торр в течение 6 часов. Далее приготовленные образцы стерилизовали в озонаторе в течение 90 мин., а непосредственно перед транс- плантацией из него получали цилиндры высотой 3,0 мм и диаметрами 3,0 и 6,0 мм.

Создание дефекта у экспериментальных животных. Исследование выполнено на 8-ми половозрелых самках кролика породы «Советская Шиншилла». Экспериментальная работа прошла все необходимые этические экспертизы и соответствовала международным рекомендациям по проведению медицинских исследований с использованием животных. Все кролики были случайным образом разделены на 2 группы (4+4).

Наружным парапателлярным способом вскрывали суставную сумку в области коленного сустава, отодвигали надколенник, обнажали мыщелки бедра. В положении сгибания коленного сустава формировали дефект в нагружаемой зоне с помощью бормашины и специально разработанного ограничителя [3] для создания повреждений заданного размера (d = 3,0 мм и d = 6,0 мм). Животным опытной группы в дефект трансплантировали полилактидный биодеградируемый носитель, в контрольной группе трансплантацию не осуществляли. Далее коленный сустав разгибали, рассасывающейся нитью 3/0 сшивали суставную сумку, окружающие ткани послойно ушивали, на кожу накладывали швы по Холстеду.

После операции животных помещали по одной особи в клетке при температуре 18–26 °C и относительной влажности 30–70 % в условиях принудительной вентиляции и искусственного освещения (по 12 часов темного и светлого времени). На седьмые сутки выполняли эвтаназию животных с помощью раствора тиопентала натрия.

Фиксация и вырезка препаратов для дальнейших гистологических исследований. С целью предотвратить разложение тканевых структур все образцы были на 72 часа помещены в 10 % забуфе-ренный формалин. После этого с помощью фрезы толщиной 0,5 мм на частоте вращения 30000 оборотов в минуту в условиях охлаждения были вырезаны фрагменты тканей. Охлаждение необходимо во избежание локального перегрева тканей в непосредственной близости от места разреза. Степерь фиксации ТИК внутри созданного повреждения гиалинового хряща оценивали визуально.

Результаты и их обсуждение

Через 7 суток с момента создания дефекта все повреждения диаметром как 3,0 мм, так и 6,0 мм, созданные на поверхности гиалинового хряща, были явно визуализированы (рис. 1). В образцах без применения полимера регенеративных изменений не отмечено в отличии от образцов с трансплантированным PLA. Полимер инте- грировался в области хирургического вмешательства только в области дефектов диаметром 3 мм. На сроке 7 суток при трансплантации полимера в область дефекта диаметром 6,0 мм он не закреплён прочно в области повреждения.

С целью уменьшения времени декальцинации, для снижения нагрева и улучшения теплоотвода была использована фреза толщиной 0,5 мм. Промежуточный этап создания таких препаратов представлен ниже на рис. 2.

В данной работе выполнено моделирование двух различных дефектов диаметрами 3,0 и 6,0 мм. В качестве экспериментального животного использовались кролики порода Шиншилла.

Дефект 3 мм без полимера. Визуализуется сферическое повреждение без признаков замещения дефекта регенератом

Дефект 3 мм с полимером. Область дефекта заполнена адгезированным полимерным носителем (светлый регенерат на поверхности гиалинового хряща)

Дефект 6 мм без полимера. Визуализируется сферическое повреждение без признаков замещения дефекта регенератом

Дефект 6 мм с полимером. Область дефекта заполнена полимерным носителем, но недостаточна адгезия к зоне дефекта

Рис. 1. Фото области повреждения после 7-ми суток с момента создания дефекта

Дефект 3 мм без полимера. Визуализуется сферическое повреждение без признаков замещения дефекта регенератом

Дефект 3 мм с полимером. Область дефекта заполнена прочно адгезированным полимерным носителем (светлый регенерат на поверхности гиалинового хряща)

Дефект 6 мм без полимера. Визуализируется значительное сферическое повреждение без признаков замещения дефекта регенератом

I

Дефект 6 мм с полимером. Область дефекта заполнена полимерным носителем без достаточной адгезии к зоне дефекта

Рис. 2. Фото области повреждения после 7-ми суток с момента создания дефекта после вырезки перифокальной области дефекта

Следует обратить внимание, что помимо кролика, для эксперимента доступны мышь, крыса и овца. Мышь и крыса, в связи с доступностью, являются популярными объектами для таких исследований. Однако, геометрические размеры коленного сустава, на котором восновном и проводятся оперативные вмешательства, накладывают операционные сложности как на создание дефекта, так и анализ полученных результатов. Выбор овцы в качестве объекта для моделирования дефекта и применения ТИК наиболее предпочтителен, однако стоимость таких экспериментов значительно выше [4].

Биодеградируемым носителем являлся поли-L-лактид. В настоящее время именно

PLA является золотым стандартом для тканевой инженерии [5].

Другим важным вопросом является выбор вида, размера и формы создаваемого дефекта, а также способа фиксации ТИК конструкции на поверхности гиалинового хряща. В результате создания повреждения 6,0 мм в диаметре, граница повреждения почти достигает границ мыщелка, и велик риск получить большее повреждение в ходе операционного вмешательства. Выбор 3,0 мм в качестве диаметра повреждения позволило получить стабильные дефекты на поверхности гиалинового хряща без потери биодеградируемого носителя, в отличие от выбора дефекта в 6,0 мм, где это наблюдается.

Для создания повреждения использовано фрезерное воздействие на высоких оборотах. По мнению авторов, адгезирова-ние полилактидного носителя происходит не только за счет трения, но и за счет пролиферации клеточной культуры на границе сред (неповреждённый хрящ – полимер). Данный вопрос требует проведения дополнительных исследований. При анализе результатов на 7-е сутки наблюдения не было отмечено признаков воспалений, нагноений и (или) смертей экспериментальных животных, что согласуется с результатами, полученными другими авторами [6, 7].

После выведения животных из экспериментов, была выполнена декальцинация образцов тканей для получения гистологических срезов. С целью уменьшения зоны декальцинации было использовано фрезерное воздействие с охлаждением образцов путем периодического смачивания в растворе формалина. Область дефекта не повреждалась за счёт высокой скорости вращения фрезы и охлаждения. В результате удалось добиться снижения линейных размеров образца до 8,0 х 8,0 х 8,0 мм. Это позволило уменьшить время декальцинации до 4 недель, поскольку выведение кальция наиболее эффективно из более тонких образцов, уместить образец в стандартную гистологическую кассету для последующей проводки, одновременно сохранив зону дефекта (и регенеративных образований) для последующего анализа.

Заключение

Метод фиксации биодеградируемого носителя в области смоделированного цилиндрического поверхностного дефекта хряща коленного сустава кролика диаметром 3,0 мм является эффективным, что и было продемонстрировано в опытной группе животных.

Выводы:

• 1.    Применение PLA в качестве скаф-фолда для клеточной культуры является эффективным и безопасным на экспериментальной модели поверхностного дефекта гиалинового хряща у кролика.

• 2.    Использование высокооборотного фрезерного воздействия позволяет подготовить вышеописанные образцы препаратов для декальцинации и дальнейших гистологических исследований.

• 3.    В проведенных экспериментах по трансплантации ТИК в область дефектов гиалинового хряща коленного сустава у кроликов оптимальным размером повреждения суставной поверхности является дефект цилиндрической формы диаметром 3,0 мм.

Список сокращений

ТИ – тканевая инженерия

ТИК – ткане-инженерная конструкция

PLA – полилактид