К вопросу о формировании полиэмбриоидов в культуре in vitro пыльников пшеницы

Метод культуры in vitro изолированных пыльников основан на использовании феномена андрок-линии (или, в другой терминологии, андрогенеза in vitro ). Андроклиния рассматривается как нетрадиционная система размножения растений, имеющая свои параллели и аналогии с другими системами размножения [2-4, 6, 10, 11, 13].

Феномен андроклинии состоит в переключении развития инициальных клеток пыльника в условиях in vitro с обычной гаметофитной программы, ведущей к образованию пыльцевого зерна, на споро-фитную программу, ведущую к образованию гаплоидного растения-регенеранта. При этом инициальные клетки реализуют свой морфогенетический потенциал различными путями морфогенеза [1, 7, 8, 10].

Установлено, что к образованию растений-регенерантов ведут два пути морфогенеза – эм-бриоидогенез (формирование эмбриоида – биполярной зародышеподобной структуры непосредственно из инициальной клетки пыльника (прямой эмбриоидогенез) или из клетки каллуса (непрямой эмбриоидогенез)) и гемморизогенез (сопряженное формирование в каллусе почек и корней) [7, 8, 10, 13].

Биотехнологически оптимальным путем регенерации растений считается прямой эмбриоидогенез, так как он не связан со сложным многоступенчатым процессом морфогенеза через каллус, требующим трудоемкой процедуры пересадок, и предполагает работу с генетически однородным материалом [3, 5, 10, 12].

Основная проблема получения гаплоидов посредством эмбриоидогенеза в культуре in vitro изолированных пыльников – низкий выход растений-регенерантов. Один из способов решения этой проблемы – индукция образования особого типа эмбриоидов, для которых характерно формирование в их апикальной части множественных точек роста. Как полагают Cistue et al . [16], что получение таких эмбриоидов позволит увеличить количество растений-регенерантов.

Однако возникает вопрос о происхождении таких эмбриоидов – формируются ли они каждый из

отдельных инициальных клеток пыльника или же образуются в результате слияния нескольких эмбриоидов, сходных по строению с зиготическими зародышами. Этот вопрос имеет принципиальное значение. Действительно, если такие эмбриоиды имеют одноклеточное происхождение, то все полученные растения-регенеранты будут представлять собой клоны. Если же такие эмбриоиды формируются в результате слияния нескольких эмбриоидов, подобных зиготическим зародышам, особенно на ранних этапах развития, возникает риск получения химерных растений-регенерантов.

В литературных источниках имеются только единичные упоминания о формировании такого типа эмбриоидов андроклинного происхождения [3, 14-18, 21, 22] и полностью отсутствуют данные об их генезисе. В то же время изучение генезиса полиэмбриоидов имеет несомненное практическое значение, поскольку при условии одноклеточного происхождения полиэмбриоидов предоставляется возможность значительно увеличить количество дигаплоидных растений-регенерантов, являющихся клонами исходных родительских форм, обладающих хозяйственно-ценными признаками.

Следует отметить, что термин, касающийся названия таких эмбриоидов, отсутствует. Некоторые авторы называют их зародышеподобными структурами [18;19,20], другие – эмбриоидами или каллусами [17]. Мы предлагаем называть эмбриоиды такого типа полиэмбриоидами.

Целью исследования был вопрос о происхождении полиэмбриоидов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом исследования послужил сорт яровой мягкой пшеницы Жница, характеризующийся высокой частотой образования in vitro андроклинных структур и интенсивно использующийся в селекционной практике Башкирского НИИ СХ РАСХН. Морфологические и цито-гистологические особенности формирования полиэмбриоидов изучали методами световой (СМ) (µVizo-103, ЛОМО ФОТОНИКА, г. Санкт-Петербург) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) (JSM 35, Jeol, Japan и JSM-6390, Jeol, Japan, на базе БИН РАН, г. Санкт-Петербург).

Следует отметить, что изучение развития мик-роспориальных эмбриоидов в условиях in vitro со- пряжено с рядом трудностей методического харак-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

тера, связанных, в первую очередь, со сложностью ориентации объектов при приготовлении срезов из-за их мелких размеров (особенно на ранних стадиях), частых отклонений в форме, а также отсутствия маркеров типа рубчика семени, имеющихся у зиготического зародыша. Существенную помощь в этом вопросе оказывает метод сканирующей электронной микроскопии, еще недостаточно широко используемый в исследованиях такого рода, но позволяющий получить точное представление о пространственной организации эмбриоидов в динамике их развития.

Последующий цито-гистологический анализ тех же эмбриоидов дает информацию о тонких деталях их строения в динамике развития, позволяя совместить объемное поверхностное изображение объекта с его внутренним строением.

Ранее [9, 13] было установлено, что инициальная клетка андроклинии – сильновакуолизирован-ная микроспора. В результате воздействия низкими положительными температурами in situ сильнова-куолизированные микроспоры отрываются от стенки пыльника, теряют свою полярную организацию и приобретают типичную «звездчатую» структуру. На 3-е сут от момента инокуляции пыльников на индукционную среду in vitro в таких деполяризованных микроспорах отмечены равные (симметричные) митотические деления с образованием сначала двух равных ядер, а затем двух равных клеток.

Согласно полученным нами данным, на 9-е сут от начала культивирования in vitro в результате дальнейших равных делений обеих образовавшихся клеток формируются четырехклеточный (рис. 1), а на 11-е сут – многоклеточный полиэмбриоид (рис. 2).

Рис. 1. Четырехклеточный полиэмбриоид (9-е сут культивирования пыльников in vitro ). а – СЭМ; б – СМ, постоянный препарат. Условные обозначения: Оп – оперкулум, ОбМс – оболочка микроспоры

Рис. 2. Многоклеточный полиэмбриоид (11-е сут культивирования пыльников in vitro ). а – СЭМ; б – СМ, постоянный препарат. Условные обозначения: МП – многоклеточный полиэмбриоид, ОбМс – оболочка микроспоры, Св – связник, СтПл – стенка пыльника.

Все клетки полиэмбриоида на начальных этапах развития сходны по размерам и структуре (рис. 1б, 2б), а сам полиэмбриоид имеет глобулярную форму (рис. 1а, 2а).

Снаружи полиэмбриоиды окружены общей утолщенной оболочкой, наружная часть которой представляет собой оболочку микроспоры (рис. 1, 2).

В дальнейшем интенсивный рост полиэмбриоидов приводит к растяжению и механическому разрыву сначала оболочки микроспоры, а затем и стенки гнезда пыльника. На 21-24 сут культивирования in vitro полиэмбриоид появляется на поверхности пыльника.

Проведенный нами детальный анализ морфогенеза полиэмбриоидов в динамике развития позволил установить, что эти структуры, так же как и эмбриоиды, сходные по строению с зиготическими зародышами, имеют одноклеточное происхождение.

Такой вывод основан на следующих данных. Инициальными клетками и в том, и в другом случае являются сильновакуолизированные микроспоры. Дальнейшие деления приводят к формированию глобулярных многоклеточных структур. На начальных этапах развития такие многоклеточные структуры окружены единой оболочкой материнской микроспоры. Одноклеточное происхождение полиэмбриоидов также подтверждается развитием их сосудистой системы, которая с самого начала развивается как единое целое, объединяя все органы развивающегося полиэмбриоида, что было бы невозможным в случае формирования полиэмбриоидов как результата срастания нескольких эмбриоидов.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 08-04-97045) и поддержана программой «Ведущие научные школы РФ» (грант № НШ 7637.2010.4, лидер Школы – член-корр. РАН Т.Б. Батыгина, БИН РАН, Санкт-Петербург).