К вопросу о механизмах возникновения оксидативного стресса в эритроцитах организма-опухоленосителя

Введение. Считается установленным, что развитие неоплазмы в организме сопровождается нарушением морфофункционального состояния эритроцитов циркулирующей крови [1]. В частности, имеет место активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) и изменение активности ферментативного звена антиоксидантной системы (АОС), что характери- зует ситуацию оксидативного стресса (ОС) [2]. При этом в качестве основного фактора, определяющего развитие ОС, рассматривается накопление в эритроцитах промежуточных продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА)) в результате системного действия опухоли на организм [3– 5]. Таким образом, активация свободноради- кального окисления является типовым эфферентным звеном в реализации системного действия опухоли на организм. Единого мнения относительно активности ферментов АОС и их роли в развитии ОС в динамике развития неоплазмы на сегодня не существует [6–10].

Цель исследования. Оценка роли ферментативного звена АОС и системы глутатиона в возникновении ОС в эритроцитах крыс с перевиваемой асцитной опухолью яичников (АОЯ).

Материалы и методы. Работа выполнена на белых беспородных крысах массой 180–200 г с перевиваемой АОЯ (штамм РЯ, РОНЦ им. Н.Н. Блохина, г. Москва) в стационарную (n=22) и терминальную (n=22) фазы роста опухоли. Контрольную группу составили здоровые половозрелые крысы (n=24). Все животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении и свободном доступе к воде и корму. Работа проводилась в соответствии с Правилами проведения работ и использования экспериментальных животных, утвержденными Приказом МЗ СССР № 755 от 12 августа 1977 г., положениями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг., а также требованиями этического комитета Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета. Животных умерщвляли путем декапитации под эфирным наркозом.

Для оценки продуктов ПОЛ в гемолизате эритроцитов (1:10) оценивали уровень ДК – при Е 232/220 нм , кетодиенов (КД) – при Е 278/220 нм , шиффовых оснований (ШО) – при Е 400/220 нм по методу И.А. Волчегорского [11]. Содержание МДА определяли в тесте с тиобарби-туровой кислотой по методу Л.И. Андреевой [12]. Для оценки ферментативного звена АОС изучали активность супероксиддисму-тазы (СОД) по методу M. Nishikimi [13], каталазы, глутатион-S-трансферазы (ГТ) и глутатионпероксидазы (ГПО) по методу А.И. Карпищенко [14]. Активность глутати-онредуктазы (ГР) устанавливали по методу В.С. Асатиани [15]. Уровень восстановленного (GSH) и окисленного глутатиона (GSSG) определяли по методу G.L. Ellman [16]. Активность ферментов и количество продуктов ПОЛ пересчитывали на 1 г гемоглобина.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни (Stata 6.0) и стандартных пакетов Microsoft Excel 2007. Различия считали статистически значимыми при p≤0,05.

Результаты и обсуждение. В результате проведенных исследований нами установлено значимое по сравнению с контролем повышение МДА и ДК. Изменение уровней КД и ШО в эритроцитах крыс в динамике развития АОЯ не было статистически значимым (рис. 1).

Рис. 1. Содержание продуктов ПОЛ в эритроцитах крыс с АОЯ.

* – данные, достоверно отличающиеся от аналогичных данных в контроле (р≤0,05)

Таким образом, полученные нами данные по параметрам ПОЛ в эритроцитах крыс с АОЯ укладываются в концепцию Н.П. Чесноковой с соавт. [9] и позволяют предполагать, что накопление в эритроцитах промежуточных продуктов ПОЛ (ДК и МДА) является следствием системного действия опухоли на организм.

Несколько иная ситуация имеет место при оценке активности в эритроцитах ферментативного звена АОС.

Рассмотрим схему образования и обезвреживания активных форм кислорода (АФК) в эритроцитах (рис. 2):

Глюкоза

Глюкозо-6-фосфат

Гликолиз глюкозо-6-фосфат

| N 6-фосфоглюконат

Глицеральдегид-З-фосфат

NAD+ NADH+H*

Г люкозо-6-фосфат

.метгемоглобин

ADPH+H"

NADP

Глюкозо-6-фосфа дегидрогеназа

GSSG

2GSH лутатион-редуктаза

1,3-Фосфоглицерат

редуктазная система

2,3 -бифосфоглицерат

HbFe2 оксиНЬ

HbFe3+ метНЬ

ИНгО /'Глутатион пероксидаза

3-фосфоглицерат

М1 АТР ЛаЮгат

Рис. 2. Образование и обезвреживание АФК в эритроцитах [17]

• 1.    Источником супероксидного аниона (О₂^-) в эритроцитах является спонтанное окиcление Fe²⁺ в геме Hb. И поскольку кислорода в эритроцитах много, то скорость образования О 2 ^-, Н 2 О 2 и ОН^- высокая;

• 2.    СОД превращает О 2 ^- в Н 2 О 2 и О 2 .

• 3.    Н 2 О 2 расщепляется каталазой или ГПО.

• 4.    ГР восстанавливает GSSG.

• 5.    На окислительном этапе пентозофос-фатного пути превращения глюкозы образуется NADPH, необходимый для восстановления глутатиона.

• 6.    В глицеральдегидфосфатдегидроге-назной реакции гликолиза образуется NADH, участвующий в восстановлении железа мет-гемоглобинредуктазной системой.

Hb (Fe²⁺)   ē + O 2     O 2 ^-    Н 2 О 2    Н 2 О + OH^-

ē, 2H+

MetHb (Fe3+)

Нами установлено повышение активности СОД и каталазы по сравнению с контролем в стационарную и терминальную фазы роста опухоли (рис. 3). На сегодня не существует единого мнения относительно активности СОД и каталазы в динамике развития опухоли. По данным одних авторов [6–8, 18], активность СОД и каталазы в эритроцитах организма-опухоленосителя снижается, при этом авторы полагают, что прогрессирующая недостаточность активности СОД определяет системную активацию процессов ПОЛ при злокачественных опухолях определенной локализации [9]. Данные других авторов [10, 19–20] свидетельствуют о повышении активности этих ферментов. При этом существует мнение, что увеличение в эритроцитах активности антиоксидантных ферментов может быть компенсаторной реакцией в ответ на усиление ОС [10].

В доступной литературе мы обнаружили данные, свидетельствующие о разнонаправленной динамике СОД и каталазы в эритроцитах опухоленосителей по сравнению с контролем [9, 21].

Рис. 3. Активность СОД и каталазы в эритроцитах крыс с экспериментальным АОЯ. * – данные, достоверно отличающиеся от аналогичных данных в контроле (р≤0,05)

В литературе также представлены данные о фазности изменений антиоксидантной активности крови организма-опухоленосите-ля [22]. Для объяснения Е.А. Нейфахом в 1960-е гг. было высказано предположение, что опухоль «выкачивает» антиоксиданты из других органов и тканей. При этом удаление опухоли приводит к нормализации активности ПОЛ в крови, что позволяет предполагать определяющую роль опухоли в формировании антиоксидантного статуса организма-опухоленосителя.

Образовавшийся при окислении Fe2+ О2-СОД далее превращает в Н2О2+О2, а уже каталаза расщепляет Н2О2. Расщеплять Н2О2 может также ГПО, активность которой, по нашим данным, в стационарную фазу АОЯ не отличалась от контроля, а в терминальную фазу была значимо снижена по сравнению с контролем (рис. 4). Снижение активности ГПО в эритроцитах зарегистрировано также у больных раком шейки матки [23]. GSSG восстанавливает ГР, активность которой, по нашим данным, также была снижена в эритроцитах в динамике АОЯ (рис. 4).

Анализ вышеизложенного позволяет предполагать, что активность ферментов АОС в эритроцитах организма-опухоленоси-теля, определяемая условиями гипоксии, развивающейся в организме при развитии солидной опухоли, гетерогенностью опухоли, усилением активности моноцитов, осуществляющих противоопухолевый иммунный ответ, является важной составляющей биологического портрета опухоли в динамике ее развития.

Рис. 4. Активность глутатионзависимых ферментов в эритроцитах крыс с АОЯ. * – данные, достоверно отличающиеся от аналогичных данных в контроле (р≤0,05)

Субстратом для ГПО, расщепляющей Н2О2 и пероксиды липидов, является глутатион. Глутатион – тиолсодержащий трипептид – осуществляет защиту клетки от ксенобиотиков, свободных радикалов и гидропероксидов. Он функционирует в качестве антиоксиданта, участвуя в разрушении перекиси водорода и пероксидов липидов, обеспечивая субстрат для ГПО. В эритроцитах периферической крови, наиболее страдающих от активности свободных радикалов при раз- витии в организме неоплазмы, его содержится значительное количество. При снижении потенциала глутатионовой защиты в эритроцитах повышается содержание АФК, что вызывает окисление SH-групп молекул Hb.

Образование дисульфидных связей между протомерами Hb и метHb приводит к их агрегации – образованию телец Хайнца, которые способствуют разрушению эритроцитов при попадании их в мелкие капилляры.

Рис. 5. Уровни GSH и отношение GSH/GSSG в эритроцитах в динамике АОЯ. * – данные, достоверно отличающиеся от аналогичных данных в контроле (р≤0,05)

Нами установлено прогрессирующие снижение уровня GSH и отношения GSH/GSSG в эритроцитах в динамике АОЯ (рис. 5). Снижение окислительно-восстановительного статуса глутатиона (GSH/GSSG) имело место в крови мышей с опухолью Эрлиха [24], в эритроцитах у пациентов со злокачественными опухолями различной локализации [25–26]. В то же время в литературе доступны данные о повышении GSH и GSSG в эритроцитах крыс на ранних стадиях развития гепатомы Морриса 5123 [27]. При этом авторы отмечали на поздних стадиях понижение уровня GSH и соотношения GSH/GSSG при сохраняемом повышенном уровне GSSG. Существует мнение, что расходование GSH в окислительных реакциях сопровождается генерацией GSSG, взаимодействующего с SH-группами белков. При этом величина отношения GSH/GSSG значительно снижалась, что свидетельствует о сокращении редокс-потенциала системы глутатиона. При снижении величины отношения

GSH/GSSG в условиях окислительного стресса тиоловые группы белков могут обратимо модифицироваться с образованием смешанных дисульфидов между белковыми SH-группами и SH-группами молекул с низкой молекулярной массой [28]. При этом GSH выступает в качестве «ловушки» для свободных радикалов [29], а патологические состояния, включая развитие неоплазмы, вызывают истощение GSH [26]. Полученные нами данные о динамике ГПО и ГР (снижение активности которых, возможно, является результатом влияния неоплазмы) позволяют предполагать не только и не столько истощение GSH, сколько снижение его образования в эритроцитах при развитии АОЯ.

GSH также используется ГТ для детоксикации ксенобиотиков и пероксидов. При этом осуществляется 4 основных типа реакций:

• 1)    R+GSH=HRSG;

• 2)    RX+GSH=HX+SG – нуклеофильное замещение;

• 3)    восстановление органических пероксидов до спиртов:

2GSH+ROOH=ROH+GS-GS+Н 2 О;

• 4)    Изомеризация (стероидов, простагландинов).

В реакциях 1-го и 2-го типов глутатион теряется. В реакциях 3-го типа образуется GS-SG (окисленный глутатион), который восстанавливается ГР.

Нами установлено увеличение активности ГТ в эритроцитах в динамике развития

АОЯ (рис. 4). Повышение активности ГТ в эритроцитах больных РЯ показано в работе [30]. Повышение активности ГТ представляется оправданным на фоне повышения концентрации АФК и усиления ПОЛ, однако это также ведет к истощению пула GSH.

Заключение. Полученные данные позволяют предполагать истощение пула GSH в эритроцитах крыс-опухоленосителей в результате снижения его образования и повышения активности ГТ на фоне усиления ПОЛ.