К вопросу о перспективах определения полиморфизмов генов в диагностике осложненных клинических форм хронического панкреатита

За последние десятилетие отмечается рост и «омоложение» заболеваний хроническим панкреатитом (ХП). ХП является мультифакториальным заболеванием, в развитии которого играют роль как внешние факторы риска, так и внутренние, в т.ч. генетические особенности человека [1]. Любой морфогенетический процесс является результатом действия многих генов, так называемой генной сети, которая определяет синтез ферментов и структурных белков. Исследования полиморфизмов генов в настоящее время активно проводятся в различных направлениях клинической медицины [2].

Патоморфологической основой развития хронического панкреатита является выраженная структурная перестройка, склероз и фиброз, паренхимы поджелудочной железы, что приводит к нарушению оттока секрета железы, к увеличению поджелудочной железы в размерах и, нередко, сдавлению пара- панкреатических структур [3]. ХП отличается разнообразием клинических форм [4].

К осложненным клинических формами ХП относили:

хронический абдоминальным болевой синдром, неподдаю-щийся медикаментозной терапии, либо рецидивирующий сразу же после прекращения консервативной терапии;

сдавление холедоха с развитием синдрома механической желтухи;

сдавление воротной вены с развитием синдрома портальной гипертензии;

сдавление двенадцатиперстной кишки и развитие дуодено-стаза [5].

Неосложненными клиническими формами называли такое течение ХП, при котором в период ремиссии больные не предъявляли жалоб, по результатам инструментальных и лаборатор- ных методов исследования не было получено данных о сдавлении парапанкреатических структур.

В настоящее время все большее внимание получают исследования генетических предпосылок развития хронической патологии органов пищеварения [6].

Целью исследования было изучение полиморфизма следующих генов:

• 1)    ген катионного трипсиногена PRSS1, мутация в котором приводит к устойчивости трипсиногена к аутолизу и обуславливает его более легкую аутоактивацию [7];

• 2)    ген панкреатического секреторного ингибитора трипсина SPINK1, мутации в котором нарушают процесс инактивации трипсина в ткани поджелудочной железы [7];

• 3)    ген муковисцидоза-1,2 CFTR-1,2 (ген трансмембранного регулятора муковисцидоза), мутации в генах муковисцидоза проявляются на клеточном уровне недостаточной гидратацией и защелачиванием первичного секрета железы и увеличением его вязкости [7];

• 4)    ген алкогольдегидрогеназы, мутация которого ускоряет процесс трансформации этанола в ацетальдегид и способствует накоплению его в клетках у больных с ХП.

Материалы и методы

В исследование включили 63 больных, находившихся на стационарном лечении в Центре хирургии печени, поджелудочной железы и желчевыводящих путей г. Рязани. Все пациенты были обследованы, согласно стандартам обследования больных с ХП. Получено информированное согласие всех пациентов на участие в исследовании. Все пациенты были распределены на 2 группы сравнения. Первую группу составили 31 больной, 29 мужчин и 2 женщины, в возрасте 44,8±3,29 с осложненными клиническими формами хронического панкреатита. Таким больным было показано или уже выполнено хирургическое лечение ХП. Во вторую группу были включены 32 пациента, 26 мужчин и 6 женщин, в возрасте 44,7±5,09, страдающие неосложненными клиническими формами ХП. Исследование проводилось проспективно.

Всем больным выполнялись стандартные общеклинические и биохимические анализы. Верификацию диагноза хронического панкреатита проводили с использованием общепринятых методов инструментальной диагностики: ультразвукового исследования (УЗИ), фиброгастродуоденоскопии (ФГДС), прямых методов рентгеноконтрастного исследования желчевыводящих путей и протоковой системы поджелудочной железы, компьютерной томографии (КТ) и магнитно-резонансной томографии (МРТ)[8].

• В    первой группе пациентам были выполнены следующие хирургические вмешательства:

• •    23 (74,2%) пациентам выполнена операция Фрея: доступ срединный, пересекается двенадцатиперстно-ободочная связка, отводится печеночный изгиб ободочной кишки. Доступ к поджелудочной железе осуществляется вскрытием желудочноободочной связки. Для полной экспозиции поджелудочной

железы при операции Фрея мобилизуется нижний край ее. Выделяются воротная и верхняя брыжеечная вены. Вирсунгов проток идентифицируется с помощью тонкоигольной пункции, иглу направляют косо и кзади в соответствии с предполагаемым направлением протока, нужно избегать перешейка поджелудочной железы при поиске главного панкреатического протока, чтобы минимизировать повреждение подлежащей верхней брыжеечной вены, аспирация чистой жидкости является показателем того, что проток обнаружен. Не вынимая иглы электрокоагулятором в дистальном и проксимальном направлениях продольно вскрывается главный панкреатический проток. Накладываются гемостатические швы на ткань железы параллельно краю двенадцатиперстной кишки и отступя от него 3-4 мм. Скальпелем и коагулятором вырезается центральная часть головки и крючковидного отростка c оставлением полоски ткани вдоль внутреннего края двенадцатиперстной кишки. При операции Фрея желательно сохранять переднюю панкреатодуоденальную аркаду, однако это не всегда возможно при выраженном фиброзе железы. Пересечение гастродуоденальной артерии или передней аркады, образованной верхней и нижней панкреатодуоденальными артериями, не влияет на жизнеспособность двенадцатиперстной кишки. Не рекомендуется пересекать оба этих сосуда одновременно. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить общий желчный проток, для чего он может быть интубирован металлическим проводником. Ободок ткани поджелудочной железы, содержащий ветви верхних и нижних панкреатодуоденальных артерий, сохраняется вдоль внутреннего края двенадцатиперстной кишки, справа от воротной вены сохраняется ободок ткани поджелудочной железы шириной 4- 5 мм во избежание ранения сосудов и пересечения перешейка. После резекции головки остается короткий (1 см длиной) проксимальный отрезок главного панкреатического протока, который должен быть ревизован для удаления возможных конкрементов, а зонд должен свободно проходить в двенадцатиперстную кишку. Освобождается от фиброза и сдавления псевдокистами передняя поверхность интрапанкреатической части холедоха посредством иссечения рубцово измененной железы. Далее при операции Фрея формируется одно- или двухрядный продольный пан-креатоеюноанастомоз с протоком и резецированной головкой на петле тонкой кишки, выделенной по Ру.

• •    8 (25,8%) пациентам выполнялась операция Бегера: доступ срединный, пересекается двенадцатиперстно-ободочная связка, печеночный изгиб ободочной кишки отводится кау-дально. Осуществляется широкий маневр Кохера. Доступ к поджелудочной осуществляется путем вскрытия желудочноободочной связки. Затем следует обнажение верхней брыжеечной вены у нижнего края поджелудочной. Накладываются 2-4 шва-держалки на верхний и нижний края тела железы вблизи линии резекции. Швы позволяют приподнять тело железы при отделении от воротной вены и избежать кровотечения после пересечения железы. Затем диссекция ведется между передней поверхностью воротной вены и задней поверхностью головки

поджелудочной железы, либо сверху перешейка железы, начиная от воротной вены, либо, чаще, снизу перешейка от воротной вены. После пересечения железы перешеек приподнимается и отделяется от верхней брыжеечной и воротной вен. На левом срезе поджелудочной железы необходим тщательный гемостаз с помощью нерассасывающихся монофиламентных швов. Накладываются гемостатические швы по периферии головки. Паренхима железы рассекается вдоль левой боковой стенки интрапанкреатической части холедоха в направлении большого дуоденального сосочка. После резекции головка похожа на раковину со стенкой 5-8 мм толщиной, расположенную между холедохом и стенкой ДПК. Реконструктивный этап операции Бегера выполняется петлей тонкой кишки, выделенной по Ру, которая используется для панкреатикоеюноанастомоза «конец в бок» с телом поджелудочной железы и «бок в бок» с оставшейся частью головки. Панкреатикоэнтеростомия может выполнятся одно- или двухрядным непрерывным швом нерас-сасывающейся монофиламентной нитью. При наличии стеноза интрапанкреатической части холедоха, который невозможно устранить декомпрессией и резекцией окружающей панкреатической ткани, или случайном вскрытии интрапанкреатической порции общего желчного протока стенка желчного протока фиксируется отдельными швами к тканям по типу «открытой двери» и включается в проксимальный панкреатоеюноанасто-моз.

Анализу подвергали геномную ДНК человека, выделенную из лейкоцитов цельной крови с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь» при помощи системы «SNP-экспресс-РВ» ООО НТП «Литех» (г. Москва). С образцом выделенной ДНК параллельно проводили две реакции амплификации – с двумя парами аллель-специфичных праймеров. Результаты анализа позволяли дать три типа заключений: нормальная гомозигота; гетерозигота; мутантная гомозигота.

Статистическую обработку выполняли при помощи пакета Microsoft Excel 7.0. При сравнении частот аллелей использовали критерий Фишера и . Для оценки ассоциации изучаемых полиморфных вариантов генов с риском развития осложненных форм ХП рассчитывали отношение шансов OR (Odds Ratio). OR = (a × d) / (b × c), где а – частота аллеля (генотипа) в выборке больных, b –частота аллеля (генотипа) в контрольной выборке, с – сумма частот остальных аллелей (генотипов) в выборке больных, d – сумма частот остальных аллелей (генотипов) в контрольной выборке. OR определены с 95% и 99% доверительным интервалом (CI). OR=1 рассматривали как отсутствие ассоциации; OR>1- как положительную ассоциацию («повышенный риск развития патологии»), OR<1 - как отрицательную ассоциацию аллеля или генотипа с заболеванием («пониженный риск развития патологии»).

Результаты и их обсуждение

Распределение генотипов в исследуемых группах оказалось следующим: нормальная гомозигота гена SPINK1 (AA) в первой группе определен у 29 (93,5%) больных, во второй – 31

(96,9%); гетерозигота AG встречалась соответственно у 2 (6,5%) и 1 (3,1%) больных.

Гомозиготный вариант CGC гена PRSS1 был определен у большинства: 27 (87,1%) больных в первой группе, у всех 32 (100%) – во второй группе. Гетерозиготный вариант САТ выделен в 4 случаях 4 (12,9%) у первой группы и не определен во второй группе (0%).

Изучение полиморфизма CFTR1 (мутация del508) выявило присутствие гомозигот в первой группе у 29 (93,5%) пациентов, во второй – 31 (96,9%). Гетерозиготный вариант встречался в 2 (6,5%), 2 (6,5%) случаях соответственно.

Полиморфизм CFTR2 (мутация Gly542Ter) не был выявлен ни у одного больного.

Полиморфизм гена АДГ ADH1B*1/ADH1B*2 гомозиготный вариант встретился в 1 группе в 20 (64,5%) случаев, во второй 30 (93,7%), гетерозиготы составили 11 (35,5%) и 2 (6,3%) соответственно. Число гетерозигот для гена АДГ оказалось наибольшим. Следует отметить, что по данным ранее проводимых исследований [9] в русских популяциях частота гетерозигоз составляет 5,9%.

Патологические гомозиготы не были выявлены ни в одной группе. В табл. 1 обозначено число гомо- и гетерозигот и статистические расчеты.

У одного из пациентов отмечалось наличие полиморфизма генов и АДГ и PRSS1.Наибольшее значение отношения шансов в исследуемых группах превышают единицу более чем в 8 раз, это свидетельствует о том, что носительство гетерозиготы в гене АДГ является фактором риска развития осложненных форм ХП.

Выводы

• 1.    Достоверных различий частоты встречаемости мутаций генов CFTR, SPINK1, PRSS1 в группах сравнения не определено.

• 2.    У больных с осложненным течением хронического панкреатита достоверно чаще встречается мутация гена АДГ.

• 3.    Вероятнее всего полиморфизм гена АДГ является одним из факторов, предрасполагающих к осложненному течению хронического панкреатита.

• 4.    Определение полиморфизма гена АДГ может использоваться в комплексной диагностике и прогнозировании характера течения хронического панкреатита.

• 5.    Внедрение исследований полиморфизмов генов в хирургическую практику позволит оптимизировать диагностику и прогнозирование характера течения хронического панкреатита.