К вопросу о взаимодействии некоторых штаммов родококков в условиях засоления

Вторичное засоление почв нередко может быть вызвано антропогенной активностью. При этом значительная часть солей поступает в окружающую среду вместе с буровыми водами в процессе нефтедобычи [4]. Этот факт позволяет предположить, что выбор микроорганизмов-деструкторов должен осуществляться, в том числе, с учетом способности проявлять катаболическую активность в отношении углеводородов нефти в условиях повышенных концентраций солей.

Кроме того, ориентируясь на современные тенденции в области биотехнологии защиты окружающей среды, явным выглядит стремление исследователей расширить спектр возможностей разрабатываемых ими биопрепаратов, к которым относятся и широко используемые биопрепараты-нефтедеструкторы, путем перехода от монокультур к ассоциациям. Однако бактериальные ассоциации, попадающие в окружающую среду, должны быть всесторонне изучены. В этом отношении трудно переоценить понимание всех взаимодействий и процессов, протекающих между штаммами-деструкторами.

Данная работа отражает попытку методологически подойти к начальному этапу решения обозначенной выше проблемы. В работе использовались два штамма актинобактерий из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН (акроним ИЭГМ, Rhodococcus ruber

ИЭГМ 615 и Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 271, обладающие высокой жизнеспособностью в ходе предварительных экспериментов в присутствии модельной нефти.

Для приготовления всех растворов использовалась бидистиллированная вода с удельной электропроводностью 0,3 мкСм/см. Культуры родококков выращивались в среде Лурия-Бертрани при температуре 30°С, 160 об./мин., в течение 2 сут. Полученную биомассу трижды отмывали натрий-фосфатным буфером (pH 7,0) следующего состава, г/л: Na2HPO4 - 3,53; КН2РО4 - 3,39 [2] и ресуспендировали в 0,5% р-ре NaCl до достижения значения показателя оптической плотности (ОП), равного 0,5.

Реакцию актинобактерий на выращивание при различных концентрациях NaCl изучали в стерилизованной автоклавированием среде Rhodococcus с н-гексадеканом, содержащей, г/л: KNO3 - 1, NaCl - 1 (норма), 38, 300; СаС12 - 0.02, MgSO4 - 0.2, FeC13 - 0.001; КН2РО4 и К2НРО4 по 1 [3]. Кроме того, были добавлены раствор микроэлементов (1мл/л) и Tween-80 0.0166 вес.% в качестве эмульсификационного агента. н-гексадекан автоклавировался отдельно и вносился в концентрации 1.0 об.%. Колбы со средой обрабатывали на ультразвуковом гомогенизаторе Soniprep 150 (SANYO, Япония) в течение 2 мин. непосредственно перед внесением в 96-луночные круглодонные микропланшеты (Медполимер, Санкт-Петербург).

Для совместного инкубирования суспензии клеток R. ruber и R. erythropolis равной оптической плотности смешивали в равном соотношении ввиду их сходных калибровочных данных.

Культуры инкубировали в отдельных микропланшетах для каждой концентрации NaCl. Краевые лунки не учитывались. Два центральных ряда планшета служили абиотическим контролем без инокуляции.

Среду в микропланшеты и бактериальные суспензии вносили в объеме, соответственно, 150 и 8 мкл на лунку. Инокулированные микропланшеты с крышками запечатывались с помощью парафиновой пленки Parafilm с краев для уменьшения испарения воды и инкубировались в микропланшетном шейкере-инкубаторе Titramax 1000 (Heidolph-Instruments, Германия) при температуре 29оС и 350 об./мин в течение 5 сут.

Количество жизнеспособных клеток для монокультур определяли методом точечных высевов по числу колониеобразующих единиц [1]; для совместно инкубируемых культур использовали стандартную методику. Для определения КОЕ из микропланшетов отбирались образцы из опытных лунок с помощью разработанного в R-Studio скрипта, случайно группирующего 9 образцов по трем усредненным пробам-повторностям объемом 300 мкл (по 100 мкл из каждой лунки). Дополнительно для оценки жизнеспособности клеток после отбора проб в планшеты вносили по 50 мкл йодонитротетразолия фиолетового (ИНТ) и инкубировали в течение 1 сут. до полного восстановления красителя. Показатель ОП630 окрашенных культур определяли с помощью микропланшетного фотометра Multiskan Ascent (Thermo Electron Corporation, Финляндия) с программным обеспечением Ascent Software v. 2,6 (Thermo Labsystems, Финляндия).

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью следующих компьютерных программ: R-Studio, STATISTICA v. 7.0, Microsoft Excel 2010.

Таблица 1

Сравнительная оценка жизнеспособности культур

Основные результаты исследования представлены в таблице 1. Не установлено никакой закономерности во взаимодействии двух показателей жизнеспособности. В данном случае автором отдается предпочтение традиционному методу подсчета на твердых агаризованных средах, поскольку фотометрическое определение показателей оптической плотности неравномерно осевшего на поверхности лунок осадка формазана без его точного предварительного растворения в органических растворителях вносит большое количество погрешностей в измеряемый результат.

Тем не менее, судя по числу КОЕ/мл, при нормальной концентрации NaCl в среде, скорость роста на 5 день инкубации с н-гексадеканом не различается у данных штаммов. В то же время при совместном культивировании с 0,1% NaCl численность R. ruber ИЭГМ 615 в разы превышает численность R. erythropolis ИЭГМ 271 (которая уменьшается вдвое по сравнению с монокультурой). При повышении концентрации NaCl до 3,8 % колоний R. erythropolis на поверхности мясо-пептонного агара не было найдено и вовсе, что противоречит результатам ИНТ-окрашивания. Однако численность R. ruber после 5-ти дневной совместной инкубации оказалась достоверно большей, чем после инкубирования в монокультуре. Возможной причиной этого является гибель клеток R. erythropolis с последующим высвобождением клеточных макромолекул в среду.

После высева на МПА из разведений от 10-2 не было обнаружено никаких колоний в случае 30%-ной концентрации NaCl, визуального образования формазана также не было зафиксировано.