Качественный и количественный анализ на содержание бензойной, салициловый, сорбиновой и глицирризиновой кислот в водном экстракте люцерны посевной

В современных условиях организм человека испытывает, с одной стороны, негативное действие широкого спектра техногенных факторов, с другой – ксенобиотических субстратов, входящих в состав продуктов питания. Увеличению доли ксенобиотиков в составе пищевых продуктов, безусловно, способствует широкое применение ядохимикатов (пестицидов) при сельскохозяйственных работах как средств химической защиты растений, а именно: хлор-, фосфор-, ртутьоргани-ческих соединений и нитрофенолов. Остаточные количества вышеперечисленных ядохимикатов в составе пищевых продуктов способны депонироваться в организме человека оказывая общетоксическое, политропное и сенсибилизирующее воздействие, что приводит к патофизиологическим сдвигам, явлениям патоморфоза внутренних органов и аллергическим реакциям. Увеличению доли ксенобиотитков в составе продуктов питания способствует добавление консервирующих веществ, в том числе химических соединений с побочными эффектами. Изучению побочного воздействия консервантов посвящены многочисленные исследования, результаты которых отражены в публикациях отечественных и зарубежных авторов [1–5]. Наиболее широко применяемый консервант бензоат натрия (Е-211) проявляет in vivo широкий спектр побочных эффектов путём ингибирования внутриклеточных антиоксидантов – Fe-зависимой каталазы и Se-зависимой глутатионпероксидазы, катализирующих реакции обезвреживания Н2О2 при её высоких концентрациях [6–10]. В настоящее время отмечаются тенденции к уменьшению ксенобиотиков в пищевых продуктах, в том числе снижением абсолютного количества химических консервантов путем их сочетания с природными пищевыми добавками, которые характеризуются высокой антимикробной, фунгицидной и антиоксидантной активностью. Одно из новых направлений в технологиях консервирования пищевых продуктов – использование наземных частей растений Artemisia campestris L (полынь горькая), содержащих в своём составе эфирные масла (1,8-цинеол, камфора, артемзия-спирт и др.), проявляющие высокую антимикробную активность и фунгицидную активность [11]. Согласно органолептической и дегустационной оценки, реализованной авторами, сырье данных видов не содержит горечи, что указывает на перспективность его использования в пищевой промышленности в качестве натурального консерванта [11]. В качестве источника натуральных консервантов растительного генеза используется экстракт плодов брусники и клюквы, содержащие в своем составе широкий спектр органических кислот с антиоксидантной и антимикробной видами активности: бензойную, лимонную, яблочную, винную, щавелевую, салициловую, α-кетоглутаровую, молочную и уксусную [12]. Установлено, что сок ягод брусники подавляет рост и размножение грибов рода Candida, а также проявляет бактерицидные свойства по отношению к Staph. puogenusaureus, Вас. colicommunis, Proteusvulgaris [13]. Безусловно, следует считать актуальными исследования, направленные на выявление новых видов консервантов натурального происхождения с целью уменьшения количества ксенобиотических субстратов в консервированных видах пищевой продукции. Представляет несомненный интерес выявление биологически активных веществ с антиокисли-тельной и антимикробной активностью в составе плодово-ягодных культур и лекарственных растениях, обеспечивающих реализацию консервирующих свойств в отношении органической составляющей пищевой продукции.

Цель работы – выявление спектра консервантов натурального генеза в водном экстракте люцерны посевной, обеспечивающих пролонгирование сроков хранения пищевой продукции.

Материалы и методы

В качестве натурального консерванта использовали экстракт растительный конденсированный люцерны посевной ( Medicago sativa L .), полученный из наземной части растения методом гидробарометрического экстрагирования (свидетельство ГОС. РЕГ. РФ: № RU № 77.99.88.003Е.000027.01.18 от 10.01.2018 г., выданное НПО ООО «Эраконд»). Водный экстракт люцерны посевной, реализуемый под торговой маркой БАД «Эраконд», характеризуется наличием широкого спектра биологически активных веществ, способных in vivo коррегировать патофизиологические сдвиги при патологиях различного генеза [14]. Одна из задач настоящих исследований состояла в качественном и количественном анализе бензойной, салициловой, сорбиновой и глицирризиновой кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в спиртовом экстракте люцерны посевной ( Medicago sativa L .) и в БАД «Эраконд».

Количественное определение кислот проводилось методом ВЭЖХ в стандартных растворах на хроматографе Waters Breeze (Waters, США) со спектрофотометрическим детектором. Определение проводили на колонке РursuitС18, 4.6 x 250 мм, 5 мкм (Agilent Technologies, Нидерланды). В качестве подвижной фазы применили элюент метанол – 0.3 н уксусная кислота от 80 до 20 (об.%). Скорость потока подвижной фазы составляла 1.0 мл/мин. Анализируемые образцы объемом 50 мкл вводили в хроматограф с использованием автосамплера и записывали хроматограмму. Время анализа 20 мин. Детектирование проводилось при аналитических длинах волн 254 и 305 нм.

В коническую колбу вместимостью 250 мл помещали 10 г. измельченного воздушно-сухого сырья люцерны и приливали 100 мл 70 %-го этилового спирта. Экстрагировали в течение 4 часов при периодическом перемешивании при комнатной температуре. Полученный раствор фильтровали через фильтр Шотта с размерами пор 100 мкм. Экстракцию повторяли еще 2 раза. Объединенный спиртовой экстракт упаривали на роторном испарителе Heidolph (Германия). Количество извлеченных экстрактивных веществ определяли весовым методом после удаления растворителя и достижения постоянной массы колбы с высушенным экстрактом.

Результаты

На первом этапе работы строили градуировочные графики стандартных растворов бензойной, сорбиновой, салициловой и глицирризиновой кислот. Растворы стандартных веществ с концентрациями 0.25, 0.5 и 1.0 мг/мл для глицир-ризиновой кислоты, 0.005, 0.01 и 0.02 мг/мл для сорбиновой кислоты, 0.20, 0.5 и 1.0 мг/мл для салициловой кислоты и 0.36, 0.25 и 0.10 мг/мл для бензойной кислоты готовили путем растворения навесок соответствующих веществ в элюенте метанол: 0.3 н уксусная кислота = 80 : 20 (объем. %) в мерных колбах на 25 мл. Для каждого стандартного раствора записывали хроматограмму по вышеописанной методике.

Пробу экстрактов объемом 50 мкл вводили в хроматограф с использованием автосамплера и записывали хроматограмму. Каждый образец анализировали по 4 раза. Растворы экстрактов в элюенте готовили с концентрацией 5 мг/мл (для спиртовых экстрактов люцерны) и 10 мг/мл (для БАД «Эраконд»). По площадям пиков веществ с определенным временем выхода, с использованием градуировочных графиков стандартных веществ определяли концентрации кислот в экстрактах. Статистическую обработку проводили по результатам 4 определений каждого образца. Хроматограммы водно-спиртовых экстрактов люцерны приведены на рисунке 1. На рисунке 2

представлены хроматограммы образца БАД «Эра-конд», произведенной из люцерны посевной.

AU ------

1.2 ■              1

Рисунок 1. Хроматограмма водно-спиртового экстракта люцерны 5мг/мл при 254 нм

Figure 1. Chromatogram of an aqueous-alcoholic extract of alfalfa 5 mg/ml at 254 nm

Вещество со временем выхода 4.08 мин. (пик 5) – бензойная кислота; 3.82 мин. (пик 4) – сорбиновая кислота; 4.50 мин. (пик 6) – салициловая кислота; 7.86 (пик 8) и 8.61 мин. (пик 9) – α- и β-глицирризиновоя кислота, соответственно.

Рисунок 2. Хроматограмма образца БАД «Эраконд» 10 мг/мл при 254 нм

Figure 2. Chromatogram of a sample of dietary supplement «Erakond» 10 mg/ml at 254 nm

Вещество со временем выхода 4.06 мин. (пик 8) – бензойная кислота; 3.89 мин. (пик 7) – сорбиновая кислота; 4.67 мин. (пик 9) – салициловая кислота; 8.19 (пик 11) и 8.79 мин. (пик 12) -α- и β-глицирризиновая кислота. Сопоставление времен удерживания пиков веществ на хроматограммах анализируемых образцов со временами удерживания пиков стандартных образцов позволили идентифицировать и установить количественное содержание кислот в анализируемых образцах (таблица 1).

Таблица 1.

Содержание органических кислот в пересчете на сухую массу люцерны

Table 1.

The content of organic acids in terms of dry weight of alfalfa

Кислоты | Acids		Содержание кислот, мг/г от сухой массы | Acid content, mg/g from dry weight
		Образец │ Sample
		Водно-спиртовой экстракт люцерны Aqueous-alcoholic extract of alfalfa	БАД «Эраконд»* Dietary supplement “Erakond”*
Бензойная │ Benzoic		3,2 ± 0,3	26,0 ± 3
Салициловая │ Salicylic		1,8 ± 0,2	2,9 ± 0,3
Сорбиновая	│ Sorbic	0,15 ± 0,11	0,22 ± 0,03
Глицирризиновая	│ Glycyrrhizic	2,0 ± 0,3	5,2 ± 0,6
*мг/г БАД «Эраконда» (mg/g BAA «Erakond”)

Таким образом, содержание кислот, определенное методом ВЭЖХ, в водно-спиртовом экстракте люцерны составляет: 3,2 мг/г бензойной, 1,8 ± 0,2 мг/г салициловой, 0,15 ± 0,11 мг/г сорбиновой, 2,0 ± 0,3 мг/г глицирризиновой. В БАД «Эраконд» содержится – 26,0 ± 3 мг/г бензойной, 2,9 ± 0,3 мг/г салициловой, 0,22 ± 0,03 мг/г сорбиновой и 5,2 ± 0,6 глицирризиновой кислот. Как видно из таблицы, процессы гидробариче-ского экстрагирования растительного сырья влияют на выход экстрактивных веществ: содержание бензойной кислоты в «Эраконде» составило 26,0 ± 3,0 мг/г против 3,2 ± 0,3 мг/г в водноспиртовом экстракте люцерны – увеличение 8,1 раза. Использованные технологии способствовали и значительному депонированию глицирризиновой кислоты: её содержание в «Эраконде» составило 5,2 ± 0,6 мг/г против 2,0 ± 0,3 мг/г в исходном сырье – увеличение в 2,6 раза (таблица 1).

Обсуждение

Известна технология консервирования продуктов питания [15], в частности столовых яиц с использованием 20 %-го водного экстракта люцерны «Эраконд». Преимущество способа перед аналогами – обеспечение качественных характеристик столовых яиц без применения ксенобио-тических консервантов с увеличением сроков хранения до 35 суток. В соответствии с разработанной технологией яйца выдерживают в 20 % растворе «Эраконда» в течение 1 минуты, высушивают при комнатной температуре в течение 4 часов, что обеспечивало сохранение качественных характеристик продукта в соответствии с требованием ГОСТ Р 55502–2013: высота воздушной камеры на 35-е сутки хранения – не более 7 мм, желток – прочный с чёткими очертаниями, белок плотный, прозрачный.

Выяснение механизмов реализации антиоксидантных, антиокислительных, фунгицидных, противовирусных и антимикробных свойств экстрактов растительного генеза имеет важное значение для расширения спектра применяемых в пищевой промышленности биосовместимых консервантов. Результаты собственных исследований, анализ отечественной и зарубежной литературы свидетельствуют о наличие в составе «Эраконда» ингредиентов, обеспечивающих в совокупности реализацию вышеперечисленных видов активности [16]. Идентифицированные в растительном экстракте «Эраконд» органические кислоты, как известно, реализуют бактерицидные, бактериостатические и фунгицидные свойства. Бензойная кислота (С6 Н5 OOH), относящаяся к классу карбоновых кислот ароматического ряда, реализует антимикробные и противогрибковые свойства ингибируя активность ферментов и процессы метаболизма, вызывая деструкцию биомембран во многих одноклеточных организмах, плесени и некоторых бактерий [17]. Салициловая кислота (2-гидрокси бензойная или фенольная кислота) и её производные (салицилат натрия, аспирин, салициламид) благодаря выраженному антисептическому действию находят широкое применение не только в пищевой промышленности, но и в медицине, где рекомендуются как эффективное жаропонижающее, противовоспалительное, противоревматическое и болеутоляющее средство. Выделенная из экстрактов люцерны сорбиновая кислота (транс, транс – 2,4 – гексадиеновая кислота) считается «общепризнанной безопасной» субстанцией натурального происхождения для применения в качестве пищевой добавки с антимикробной и фунгицидной активностью [17]. В отличие от вышеперечисленных органических кислот, консервантов природного генеза, экстрагированная из состава люцерны посевной глицирризиновая кислота (С42 Н65 О16), ингибирует развитие не только микроорганизмов, но и вирусов в концентрациях, не токсичных для клинически здорового человека [18].

Качество продуктов питания на этапах хранения преимущественно предопределяется интенсивностью процессов гидролиза и свободнорадикального окисления липидов. Натуральные консерванты, содержащие в своём составе антиоксиданты растительного генеза, способны ингибировать реакции свободнорадикального окисления липидов, индуцируемых так называемыми активными формами кислорода (О 2 ^• – су-пероксид-анион кислорода, О 2 Н ^• – гидроперок-сильный и ОН ^• – гидроксильный радикалы, Н 2 О 2 – пероксид водорода). Результаты ранее проведённых собственных исследований показали, что БАД «Эраконд» содержит в своём составе широкий спектр полифенольных соединений, отличающихся высокой антиоксидантной активностью. Количественное определение полифе-нольных соединений в БАД «Эраконд» методом ВЭЖХ позволило идентифицировать и установить содержание следующих флавоноидов, мг/г «Эраконда»: нарингенин – 0,05 ± 0,0006; рутин – 8 ± 3; ликуразид – 3,5 ± 0,4; кверцетин – 0,04 ± 0,001; физетин – 0,35 ± 0,01; нарингин – 0,5 ± 0,0006; дигидрокверцетин – 0,20 ± 0,002 [19].

Флавоноиды, как известно, наиболее многочисленный класс полифенольных соединений, для которых характерен широкий спектр активности и малая токсичность. В функциональном отношении флавоноиды относятся к классу фитоалексинов – растительных антибиотиков, рекомендуемых для антимикробной терапии таких заболеваний как пиелонефрит, стафилококковая пневмония, хронический пиелонефрит, а также ряда нозокоминальных инфекций. Установлено, что дигидрокверцетин проявляет выраженную антимикробную активность in vitro при концентрации 0,15 мМ и показывает большую удельную бактерицидную активность относительно традиционного антибактериального препарата Левомеколь, минимально действующая концентрация которого в отношении St. aureus составляет 24,2 мМ [20].

Многочисленные исследования показали, что флавоноиды проявляют антиоксидантную активность как в липидной, так и в водной фазах органических субстанций, ингибируют процессы свободнорадикального перекисного окисления липидов, взаимодействуя с АФК, алкоксиль-ными (RO ^• ) и пероксильными (ROO ^• ) радикалами [16, 21]. Другой механизм реализации антиоксидатных свойств флавоноидов, идентифицированных в эраконде – хелатирование металлов переменной валентности (Fе ² +, Сu ² + и Мn ² +), способных запускать каскад реакций образования АФК: О 2 ^• , ОН ^• , О 2 Н ^• , Н 2 О 2 [22].

Поликомпонентный состав растений обеспечивает многонаправленность действия консервантов растительного генеза. Люцерна посевная в своём составе содержит, помимо органических кислот и флавоноидов, другие классы природных антисептиков – куместаны и сапонины, проявляющие мягкое антиоксидантное, противомик-робное и противогрибковое действие [23].

Заключение

Результаты исследований позволили идентифицировать в водном экстракте люцерна посевной ( Medicago sativa L. ) органические кислоты (бензойная, салициловая, сорбиновая, глицир-ризиновая), ингибирующие развитие пороков пищевой продукции за счёт антисептических, фунгицидных и противовирусных свойств. Реализация антиокислительных свойств экстракта люцерны обеспечивается за счёт флавоноидной составляющей, подавляющей процессы липо-пероксидации пищевой продукции. Сочетанные действие выявленных органических кислот и флавоноидов, на наш взгляд, обеспечивает эффективность консервирования продуктов питания с использованием конденсированных водных экстрактов люцерны посевной. Следует считать перспективными исследования, направленные на идентификацию в лекарственных травах фармакологически активных органических кислот, полифенольных соединений, сапонинов и производных кумарина с целью их применение в качестве натуральных консервантов.

Хроматографический анализ выполнен на оборудовании ЦКП « Химия » УфИХ УФИЦ РАН и РЦКП « Агидель » УФИЦ РАН. Выражаем благодарность сотрудникам лаборатории ФХМА УфИХ УФИЦ РАН к. x .н., в.н.с. Иванову С.П. и к. x .н., н.с. Петровой С.Ф. за консультирование и методологическую помощь в выполнении исследований.