Калибровка (регрессия) спектрометров для определения содержания триглицеридов жирных кислот в продуктах и сыворотке крови

Триглицериды жирных кислот (ЖК) являются существенными компонентами диеты человека, обладая при этом уникальной биологической активностью [1]. Содержание клинически важных ЖК и индивидуальных триглицеридов в пище и в биологических средах традиционно определяют способами газовой и жидкостной хроматографии [2]. Из-за сложности и дороговизны эти методы труднодоступны для лабораторий клинической биохимии. Кроме того, распространение в продаже фальсификатов жиро-масляных продуктов питания приводит к потребности в портативном и оперативном анализаторе ряда характерных ЖК.

ЗАДАЧИ РАЗРАБОТКИ

Оценка возможностей БИК-спектрометра

Первая цель — адаптировать метод проекций на латентные структуры (ПЛС) [3] для оперативного определения содержания ЖК, в первую очередь пальмитиновой насыщенной и олеиновой мононенасыщенной ЖК, а также суммы полиеновых (эйкозапентаеновая + докозагексаеновая) ЖК в продуктах питания, пищевых добавках, рыбном жире с применением спектрометра ближнего инфракрасного (БИК) диапазона на линейке InGaAs фотодиодов, фото и протокол измерения которого представлены на рис. 1 [4].

При тестировании калибровок БИК-спектрометра, являющегося прототипом портативного анализатора для пальмитиновой и олеиновой, а также суммы полиеновых ЖК, достигнуты значения множественного коэффициента корреляции

а

Наименование ЖК

б

Рис. 1. Портативный БИК-спектрометр (а) и протокол определения 7 ЖК в спреде с его помощью (б).

Звездами обозначены доли ЖК, 1 — поле возможных значений ЖК в пальмовом масле, 2 — в молочном жире

0.89, 0.85 и 0.96 и стандартной ошибки 0.53, 1.43 и 0.39 % соответственно, что доказывает применимость метода для экспресс-анализа продуктов питания [5].

Разработка технологии оперативного анализа

Вторая цель — разработать технологию оперативной оценки в сыворотке крови содержания клинически важных триглицеридов пальмитиновой насыщенной, олеиновой мононенасыщенной и других ЖК на основе ПЛС-калибровки. Стандартизацию состава и содержания триглицеридов ЖК в образцах сыворотки крови для калибровки провели с традиционной экстракцией, метилированием и разделением индивидуальных ТГ с помощью высокоэффективного жидкостного хрома- а

Длина волны, мкм

б

в

Рис. 2. Графики спектральных значений.

а — коэффициенты поглощения (мм–1) различных дистиллятов воды (в логарифмической шкале); б — оптическая плотность 27 образцов сыворотки; в — продифференцированные кривые оптической плотности тех же образцов (видны вариации спектров, отнесенные к колебаниям, характерным для C–H и С=С связей)

тографа DIONEX Ultimate 3000 с использованием колонки Reprosil-Pur с наполнителем C18-AQ 3 мкм, 150×4.6 мм. В качестве детектора использовали масс-спектрометр модели ABSCIEX QTRAP 5500 при работе в режиме регистрации позитивно заряженных ионов. Спектры стандартизованных образцов сыворотки получены с применением фурье-спектрометра МРА (Брукер, Германия) в диапазоне длин волн 1.0–2.2 мкм. Они иллюстрируются на рис. 2, б, для тех же длин волн, что и спектр поглощения доминирующей в сыворотке воды — рис. 2, а. Построенные по их производным (рис. 2, в) ПЛС-модели были проверены стандартными образцами, не включенными в калибровку, и получены доказательства достоверного и селективного (в соответствии с [6]) количественного анализа названных ЖК в сыворотке крови без пробоподготовки. В результате сравнения калибровочных моделей для фурье-спектрометра в различных участках БИК-диапазона (по различным обертонам и комбинациям поглощения ЖК в сыворотке) был выбран спектральный диапазон 1.0–1.88 мкм в качестве оптимального для портативного спектрометра на базе линейки InGaAs фотодиодов. Кроме того, с применением спектрометра комбинационного рассеяния выполнена оценка содержания пальмитиновых и олеиновых триглицеридов в средах с небольшим (до 8 %) присутствием воды.

Решение двух вышеизложенных задач позволило подготовить главный результат: прослеживание 4 ЖК в пище и в сыворотке 38 пациентов показало нарушения метаболизма ЖК у 27 и состава ферментов у 16. Их регулирование в течение 2 недель привело к облегчению сердечно-сосудистого состояния у 23 пациентов. С позиций общей биологии явно позитивно, если взрослые, особенно пожилые, откажутся от потребления сливочного жира и уменьшат в пище содержание продуктов, богатых пальмитиновой ЖК: говядины, сметаны, жирных сыров. Это реальный шаг в профилактике метаболических пандемий (атеросклероз и атероматоз, метаболический синдром, резистентность к инсулину, ожирение). В связи с новыми представлениями о патогенезе атеросклероза в свете филогенетической теории общей патологии [7] особое диагностическое значение имеет отношение ЖК С16:0/C18:1 и С16:0/С18:2 в плазме крови и тканях. В настоящей работе показано, что это отношение можно оперативно диагностировать с применением БИК-спектрометра в диапазоне длин волн 1.0–1.88 мкм (см. таблицу).

Параметры тестирования моделей по спектрам 123 образцов для определения триглицеридов (ТГ), холестерина (Ch) и 4 ЖК

K , L	Н	TG			Ch			C16:0			C18:1			C18:2			C20:4
		n	r 2p	о	n	r 2 p	о	n	r 2 p	о	n	r 2 p	о	n	r 2 p	о	n	r 2 p	о
1+2+4(55, 22)	GSDer	6	0.94	1.37	5	0.86	1.49	8	0.85	119	7	0.86	194	8	0.81	183	7	0.81	102
2+1 (30, 25)	GSDer	5	0.83	1.36	5	1.79	0.61	9	0.86	117	7	0.84	126	8	0.83	112	10	0.76	113
	2GSDer	9	0.96	1.81	4	1.69	0.65	8	0.87	118	7	0.86	226	8	0.85	141	12	0.82	122
2+3 (26, 42)	Rb	10	0.87	1.4	9	0.87	10.42	6	0.91	215	7	0.91	222	7	0.93	121	10	0,61	128
	GSDer	7	0.96	1.23	5	0.88	1.4	2	0.93	112	2	0.91	122	4	0.93	114	9	0,63	118
	2GSDer	10	0.81	1.55	12	0.77	1.56	2	0.92	113	2	0.91	124	2	0.91	116	8	0.63	118
2+4 (39, 25)	GSDer	7	0.96	1.23	5	0.88	1.4	2	0.93	112	2	0.91	122	4	0.93	112	9	0.63	121
	2GSDer	10	0.81	1.55	12	0.77	1.56	2	0.92	113	2	0.91	124	3	0.91	118	10	0.64	118

Примечание. K — число калибровочных, а L — число тестирующих образцов; Н — способ обработки спектров: GSDer и 2GSDer (сглаживание и дифференцирование спектра 1 или 2 раза), Rb — удаление базовой линии; n — число латентных переменных (сложность модели); r ² p — коэффициент множественной корреляции; σ s — среднеквадратичное отклонение

Авторы глубоко благодарны Е.А. Юровой, к.т.н., зав. лабораторией технохимического контроля ВНИИ молочной промышленности РАН за предоставление стандартных образцов пищевых жиромасляных смесей.