Каллус как модельная система для изучения формирования модулей растений в условиях in vitro

По мнению Т.Б. Батыгиной [1], каллус – гетерогенная интегрированная структура (система), образующаяся в результате пролиферации клеток на поверхности отдельных структур растительного организма. Каллус формируется, как правило, из исходно разных клеток генеративных или вегетативных органов, состоит из групп неоднородных клеток, имеющих морфогенетические потенции, которые реализуются различными путями морфогенеза (эмбриоидогенез, органогенез, гистогенез). Как полагает автор, морфогенетические потенции клеток каллуса видоспецифичны и могут меняться в процессе развития, что в определенной степени зависит как от различных факторов (температура, влажность, сроки культивирования), так и от характера связей между группами клеток в каллусе, что обусловлено их формой и размером (критической массой).

Особый интерес вызывает такой путь морфогенеза in vitro каллуса, как гемморизогенез – тип органогенеза, состоящий в формировании почки ( gemma ) и корня ( rhizos ) [1], которые можно расценивать как модули организма-растения. Этот тип органогенеза ранее детально изучен в лаборатории экспериментальной эмбриологии растений Института биологии Уфимского НЦ РАН в сотрудничестве с лабораторией эмбриологии и репродуктивной биологии Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН (зав. лабораторией – член-корр. РАН Т.Б. Батыгина) на примере андроклинных морфогенных каллусов, полученных в культуре in vitro изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы. При этом на модельном объекте – гибридной линии Фотос – выявлены цитогистологические и цитофизиологические особенности формирования как морфогенных каллусов, так и почек и корней в них [3; 5; 7].

Цель данной работы – проанализировать этапы гемморизогенеза в динамике культивирования in vitro морфогенных каллусов иного – зародышевого – происхождения. Исследования проведены на том же объекте – гибридной линии Фотос. Для получения морфогенных каллусов использовали метод культуры in vitro изолированных незрелых зародышей пшеницы [14] в модификации [15] и в собственной модификации. Цито-гистологический анализ вели с применением методов световой микроскопии, модифицированных к культивируемым in vitro растительным эксплантам.

Установлено, что гемморизогенез in vitro складывается из двух этапов: сначала в морфогенном каллусе экзогенно формируется почка, затем эндогенно формируется корень. Первоочередное формирование почки по сравнению с корнем при гемморизогенезе in vitro отмечено многими авторами при анализе развивающихся каллусов различного происхождения, например, у злаков (обзор [6]).

Гемморизогенез in vitro в морфогенном каллусе а – формирование морфогенетического очага, х250; б – е – формирование почки (б – х150; в – х150; г – х400; д – х150; е – х100); ж – формирование в почке листьев 2-го порядка, х90; з – формирование корня, х60; и – формирование сосудистых элементов, х60; к – сформированные почки с корнями, х10; л – растения-регенеранты, х0,3.

а – и – постоянные препараты, продольные срезы, к – л – макросъемка.

Условные обозначения: Кр – корень, Пч – почка, СЭ – сосудистые элементы.

Цитогистологическими исследованиями выявлено, что начальным этапом гемморизогенеза (как и всех других выявленных путей морфогенеза in vitro в каллусной культуре незрелых зародышей у объекта исследований) является формирование в морфогенном каллусе групп меристематических клеток – морфогенетических очагов (рисунок, а). Морфогенетический очаг постепенно разрастается; клетки каллуса, окружающие очаг, постепенно дегенерируют. Под разрушающимися клетками каллуса наблюдается оформление эпидермального слоя морфогенетического очага, параллельно поверхности которого начинается дифференциация меристематической зоны. Разросшийся морфогенетический очаг постепенно оказывается на поверхности каллуса (рисунок, б). Интенсивные деления клеток меристематической зоны ведут как к нарастанию массы каллуса, так и к многочисленным инвагинациям его поверхности (рисунок, в). Заложение примордиев первых листьев происходит экзогенно на поверхности морфогенетических очагов. При этом к образованию примордиев ведут активные периклинальные деления клеток субэпидермальных слоев меристематической зоны (рисунок, г). Примордии первых листьев постепенно развиваются в первые листья, и формируется почка (рисунок, д, е), сходная с почкой в естественных условиях [2; 4; 13; 16]. Постепенно формируются листья второго порядка (рисунок, ж). Далее при достаточной степени развитости почки в толще морфогенного каллуса на различном расстоянии и в различной локализации относительно почки наблюдается эндогенное заложение корней (рисунок,, з, и), сходных с корнями в естественных условиях [4]. По мере развития почек и корней между ними постепенно устанавливается связь путем формирования в толще каллуса элементов сосудистой системы (рисунок, и). Такие почки, объединенные с корнем в единую систему (рисунок, к), переносили на питательную среду для регенерации и получали растения-регенеранты (рисунок, л).

Таким образом, на основании детального цито-гистологического мониторинга формирования почек и корней в морфогенных каллусах зародышевого происхождения в динамике культивирования in vitro показано принципиальное сходство полученных органов с аналогичными органами в естественных условиях. Полученные данные сходны с ранее исследованным процессом гемморизогенеза in vitro , также состоящим в последовательном экзогенном формировании почки и эндогенном формировании корня, в андроклинных морфогенных каллусах, полученных в культуре in vitro изолированных пыльников пшеницы из одной клетки – микроспоры.

В целом морфогенные каллусы (полученные в культуре in vitro как изолированных пыльников, так и изолированных зародышей), в которых экспериментально индуцируется гемморизогенез и развиваются почки и корни, могут быть рекомендованы в качестве модельных систем для изучения формирования в строго контролируемых условиях культуры in vitro органов растений как модулей.

Исследования поддержаны РФФИ-Поволжье (грант 08-04-97405) и программой «Ведущие научные школы РФ» (гранты НШ 4834.2006.4 и НШ 2096.2008.4, лидер школы – Т.Б. Батыгина).

Экспериментальные данные получены совместно с сотрудниками лаборатории экспериментальной эмбриологии растений Института биологии Уфимского НЦ РАН к.б.н. А.А. Катасоновой и к.б.н. О.А. Сельдимировой.

эмбриологический подход. Уфа, 2001.

CALLUS AS A MODEL SYSTEM FOR THE INVESTIGATION OF PLANT MODUL FORMATION IN IN VITRO CONDITIONS

Institute of Biology of Scientific Centre of Russian Academy of Sciences, Ufa

Gemmorhizogenesis as the pathway of morphogenesis in vitro was demonstrated on the example of the morphogenic callus obtained in in vitro culture of immature embryos of spring soft wheat. It was showed that the process consist in the successive formation of bud and root. The experimental data enable chance to use the morphogenic callus as a model system for the investigation of plant modul formation in strongly controlled in vitro conditions.