Кардиопротекторные свойства хлорида лития на модели инфаркта миокарда у крыс

Гребенчиков О.А., Лобанов А.В., Шайхутдинова Э.Р., Кузовлев А.Н., Ершов А.В., Лихванцев В.В. Кардиопротекторные свойства хлорида лития на модели инфаркта миокарда у крыс. Патология кровообращения и кардиохирургия. 2019;23(2):43-49. http://

Одним из вариантов защиты клетки от повреждений при ишемии-реперфузии может быть активация процесса ишемического прекондиционирования. Данный феномен, открытый C.E. Murry и соавт. в 1986 г. [1–3], заключается в том, что после серии сеансов кратковременной ишемии сердце приобретает повышенную устойчивость к повреждению в результате длительного нарушения коронарного кровотока [4–6]. Ключевым звеном защитного механизма при ишемическом прекондиционировании является фермент киназа гликогенсинтазы-3β [2, 3]. В фосфорилированном (инактивированном) состоянии киназа гликогенсинтазы-3β предотвращает открытие так называемой митохондриальной поры и гибель клетки, опосредованной повреждением митохондрий.

В последующих работах установлено, что не только пре-, но и посткондиционирование (воздействие во время реперфузии) уменьшают размер инфаркта за счет ингибирования киназы гликогенсинтазы-3β [4, 5].

В настоящее время способность инактивировать киназу гликогенсинтазы-3β в кардиомиоцитах показана для целого ряда лекарственных препаратов, таких как морфин [6] и агонисты δ-опиоидных рецепторов [7, 8], эритропоэтин [9], брадикинин [10], A1\A2 агонисты аденозина [11], ингибитор поли(АДФ-рибоза)-полиме-разы [12]; ингаляционные анестетики: ксенон [13], се-вофлуран и изофлуран [14, 15], экзогенный Zn2+ [16] и Li+ [17]. В экспериментальном исследовании на мышах было показано, что стимуляция тройничного нерва (прекондиционирование) также увеличивает фосфорилирование киназы гликогенсинтазы-3β, и тем самым обеспечивает кардиопротекцию [17]. Эффективность ингаляционных анестетиков (ксенон [13], изофлуран [3, 8]) показана не только в исследованиях на животных, данные об их кардиопротекторных свойствах получены и в клинической практике [3, 18, 19].

Таким образом, фосфорилирование киназы гликогенсинтазы-3β является ключевым молекулярным механизмом кардиопротекции, показанным для различных групп фармакологических препаратов. Поэтому, как нам представляется, изучение этого механизма является перспективным для поиска препаратов с потенциальными кардиопротекторными свойствами.

Препараты лития уже более 60 лет успешно применяются в психиатрии для лечения маниакальнодепрессивных психозов и биполярных расстройств.

Было замечено, что у пациентов с биполярными расстройствами, принимающих обсуждаемый препарат, снижен риск возникновения инсульта. Позднее многочисленные экспериментальные исследования in vitro и in vivo подтвердили нейропротекторные свойства препарата [4, 20–22].

Ион лития является самым известным ингибитором киназы гликогенсинтазы-3β. Добавление хлорида лития к культуре кардиомиоцитов при индуцированной ишемии/оксигенации обеспечивает лучшее выживание клеток, сопоставимое с ишемическим прекондиционированием [16]. Также хлорид лития уменьшает размер инфаркта в моделях с изолированным сердцем крыс [5, 20].

Эффекты хлорида лития в моделях in vivo не изучались, поэтому целью настоящего исследования явилось оценка кардиопротекторных свойств хлорида лития in vivo на модели инфаркта миокарда у крыс.

Гипотеза исследования заключалась в формировании кардиопротективного эффекта лития хлорида в условиях целостного организма при реперфузии миокарда после 25 мин ишемии на фоне окклюзии коронарных сосудов за счет увеличения содержания фосфорилированной формы фермента киназы гликогенсинтазы-3β.

Методы

В эксперименте использовано 12 самцов крыс Спрег – Доули (англ. Sprague – Dawley) возрастом 8–9 недель, массой 300–350 г. Животные случайным образом были распределены на две группы по 6 крыс в каждой. Далее у животных обеих групп моделировали ишемию сердца и последующую реперфузию. В момент начала реперфузии животным основной группы вводили хлорид лития в дозе 30 мг/кг внутривенно через катетер (примерно через 20 с после ослабления окклюдера), животным группы сравнения — физиологический раствор по той же схеме в объеме 0,5 мл/кг.

Перед манипуляциями животных подвергали уретановому наркозу (1,5 г/кг веса тела, внутрибрюшинно). Инфаркт миокарда у крыс моделировали путем окклюзии левой коронарной артерии с ее последующей реперфузией по общепринятой методике [23].

Окклюзию левой коронарной артерии проводили следующим образом: у наркотизированного животного при искусственной вентиляции легких (аппарат UGO BASILE 7025, Италия; частота дыхания

60 мин-1) выполняли торакотомию слева в четвертом межреберье. Затем рассекали перикард, визуально определяли положение общего ствола левой коронарной артерии, при помощи атравматической иглы подводили под него полиамидную нить (ETHILON 6-0). В конце манипуляций нить помещали в полиэтиленовую трубку РЕ-10, получая окклюдер для моделирования обратимой ишемии миокарда [4].

Для остановки кровотока нити затягивали и фиксировали гемостатическим зажимом [25]. После периода окклюзии проводили реперфузию — восстановление кровотока путем высвобождения артерии. Окклюзия длилась 25 мин. Длительность реперфузионного периода составляла 90 мин.

Адекватность данной методики моделирования инфаркта доказана ранее в экспериментальных исследованиях [5, 7, 12, 24].

Гемодинамические параметры измеряли в исходном состоянии, до момента наступления окклюзии, а также во время отсутствия кровотока в левой коронарной артерии и реперфузии. Для контроля наличия ишемии миокарда у животных регистрировали электрокардиограммы в грудном отведении. Признаками развития ишемии миокарда считали подъем сегмента ST выше изоэлектрической линии, снижение зубца R или его замену комплексом QS.

По завершении эксперимента методом двойного окрашивания 2%-м метиленовым синим и 1%-м трифенилтетразолием хлоридом у каждого животного рассчитывали общую площадь зоны риска, площадь зоны инфаркта и площадь миокарда левого желудочка. Для определения зоны миокарда, лишенной кровоснабжения (зоны риска), в ходе эксперимента в момент окончания реперфузии в бедренную вену животного вводили 2 мл 2%-го раствора метиленового синего, который окрашивал в синий цвет только кровоснабжаемую часть миокарда. Для идентификации некротизированных участков миокарда (зоны инфаркта) срезы левого желудочка толщиной 2 мм в течение 15 мин при температуре 37 °С окрашивали 1%-м трифенил-тетразолием хлоридом. В зоне риска живая ткань окрашивалась в красный цвет, некротизированные участки оставались неокрашенными. После окраски срезы фиксировали в 10%-м формалине, затем сканировали с двух сторон и обрабатывали с помощью компьютерной планиметрии. Окончательные результаты получали в виде процентных соотношений общей площади зоны риска к общей площади левого желудочка сердца (ЗР/ЛЖ, %), а также отношения площади зоны инфаркта к общей площади зоны риска (ЗИ/ЗР, %). О наличии кардиопро-текторных свойств у изучаемых соединений судили по способности уменьшать соотношение площади зоны инфаркта к общей площади зоны риска [4].

Для оценки содержания киназы гликогенсинтазы-3β в ткани миокарда выполнена отдельная серия экспериментов. В эксперименте использовано 15 самцов крыс Спрег – Доули возрастом 8–9 недель, массой 300–350 г. Животных случайным образом распределили на три группы по 5 крыс в каждой: основная группа, получившая хлорид лития; группа сравнения, получившая физиологический раствор, и группа контроля. Контролем служили ложнооперированные крысы, которым не вводились препараты кроме анестезии при разрезе кожи. Вышеописанным способом у животных обеих групп моделировали ишемию сердца и последующую реперфузию. В конце каждого эксперимента у животных извлекали сердце и измельчали его скальпелем в течение 30 секунд, затем с гомогенатом проводили манипуляции, описанные нами ранее [27]. Гомогенат растворяли в буфере, содержащем 0,125 М Tрис-HCl (pH 6,8), 4% додецилсульфата натрия (Sigma Chemical Co., США), 20% глицерина, 0,005% бромфенола синего (Sigma Chemical Co., США) и 10% 2β-меркаптоэтанола (Merck, Германия). Затем в течение 2 мин образцы кипятили на водяной бане, после чего их переносили в 15%-й трис-глициновый полиакриламидный гель в концентрации 50 мг белка на лунку. Электрофорез проводили при постоянном токе 10 мА в режиме концентрирования и 15 мА в режиме разделения. По окончании электрофореза переносили белки на мембрану из поливинилиденфторида (Amersham Pharmacia Biotech, UK). Мембраны блокировали в 5%-м обезжиренном молоке на 0,1%-м фосфатном буфере, затем инкубировали с первичными антителами против киназы гликогенсинтазы-3β (Mouse Monoclonal 1:1000, Cell Signaling, USA) или фосфорилированной формы киназы гликогенсинтазы-3β (Mouse Monoclonal 1:1000, Cell Signaling, USA). Далее мембраны инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Calbiochem, USA), в разведении 1:10000. Детекцию связанных антител проводили с помощью хемилю-

Таблица 1 Значения отношения площади зоны инфаркта к зоне риска и зоны риска к зоне инфаркта у контрольных животных и животных с введением хлорида лития в момент реперфузии

Группа	Площадь зоны инфаркта /площадь зоны риска, % M (SD)	Площадь зоны риска /площадь левого желудочка, % M (SD)	Препарат
Сравнение (n = 5)	41,61 ± 2,44	35,17 ± 4,97	Физиологический раствор 0,5 мл/кг при реперфузии
Основная (n = 5)	30,55 ± 5,46 *	34,66 ± 3,29	Хлорид лития в дозе 30 мг/кг при реперфузии

Примечание . *p<0,05 относительно группы сравнения (U-критерий Манна – Уитни). Данные представлены в виде среднего (M) и стандартного отклонения (SD)

минесцентного субстрата пероксидазы хрена ECL (Еnhanced Chemiluminescence System, Amersham Pharmacia Biotech, UK). Хемилюминесценция детектировалась на фотопленку. Отсканированные изображения анализировали с помощью программы ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA). Интенсивность сигнала белка фосфокиназы гликогенсинтазы-3β нормализовали к интенсивности общего белка киназы гликогенсинтазы-3β для каждой полосы.

Все эксперименты проведены в соответствии с международными рекомендациями и российскими нормативно-правовыми документами: Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (EST № 123 от 18 марта 1986 г., Страсбург); Приказом Минздрава России от 01.04.2016 N 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики»; ГОСТ 33044-2014, Межгосударственный стандарт, Принципы надлежащей лабораторной практики (введен в действие Приказом Росстандарта от 20.11.2014 N 1700-ст), а также одобрены этическим комитетом ФГБНУ «Федеральный научно-клинический центр реаниматологии и реабилитологии» (протокол № 14/03, 01.03.2018).

Статистический анализ

Для всех количественных данных применена описательная статистика. Данные проанализированы с использованием непараметрического U-критерия Манна – Уитни. Статистический анализ выполнен в программе Statistica 7.1. Различия определялись при 5%-ом уровне значимости.

Результаты

Во время экспериментов летальность в контрольной и основной, с введением хлорида лития, группах составила по одному животному. Смерть наступала в результате остановки сердца животного в момент окклюзии левой коронарной артерии до момента введения препаратов.

Определение соотношения общей площади зоны риска к общей площади левого желудочка сердца не выявило различий у животных обеих групп (табл. 1), что указывает на стандартный уровень перевязки левой коронарной артерии и равные начальные условия ишемии миокарда в исследуемых группах.

В группе животных, получавших хлорид лития в начале реперфузии, наблюдалось достоверное снижение зоны инфаркта по сравнению с группой живот-

Таблица 2

Результаты денситометрического анализа вестерн-блота на содержание белка киназы гликогенсинтазы-3β (общий) в кардиомиоцитах исследуемых крыс, Me [LQ–HQ]

Группа	Киназа гликогенсинтазы-3β, у. е. л.	%
Контроль	857454	100
(n = 5)	[770256–880934]
Сравнение	895756	104
(n = 5)	[820343–915855]
Основная	799721	93
(n = 5)	[740828–810927]

Примечание. у. е. л. — условные единицы хемилюминесценции

Таблица 3

Результаты денситометрического анализа вестерн-бло-та на содержание фосфорилированной формы белка киназы гликогенсинтазы-3β в кардиомиоцитах исследуемых крыс, Me [LQ–HQ]

Группа	Фосфокиназа гликогенсинтазы-3β, у. е. л.	%
Контроль (n = 5)	777780 * [720756–801957]	100 *
Сравнение (n = 5)	815790 * [730956–825850]	105 *
Основная (n = 5)	1505921 [1495821–1588929]	194

Примечание. у. е. л. — условные единицы хемилюминесценции; * p<0,01 при попарном сравнении ных, получавших физиологический раствор. Разница между показателями обеих групп составила более 26% (р<0,05).

При сравнении трех групп (табл. 2) по уровню содержания общего белка киназы гликогенсинтазы-3β в кардиомиоцитах статистически значимых различий не выявлено. Данный факт свидетельствует о сопоставимости животных разных групп и отсутствии влияния хлорида лития на уровень содержания общего белка киназы гликогенсинтазы-3β.

Вместе с тем обнаружено увеличение фосфокиназы гликогенсинтазы-3β в кардиомиоцитах крыс, которым вводили хлорид лития, до 200% (р<0,01) по отношению к группам контроля и сравнения (табл. 3).

Обсуждение

В нашем исследовании доказано защитное действие 4,2%-го раствора лития хлорида в дозе 30 мг/кг, введенного в момент начала реперфузии, в отношении кардиомиоцитов на модели инфаркта миокарда у крыс. Данное действие заключалось в уменьшении зоны инфаркта в сравнении с контрольными животными и, вероятно, было опосредовано практически двукратным ростом содержания фосфорилированной формы белка киназы гликогенсинтазы-3β в миокарде.

Ранее схожий результат получила группа исследователей во главе с M. Juhaszova [16], но in vitro . Авторы показали, что хлорид лития в среде культивации кардиомиоцитов при часовой ишемии и 3-часовой реоксигенации обеспечивает лучшее (более чем в 6 раз, р<0,05) выживание клеток по сравнению с группой контроля. Необходимо отметить, что результат, полученный в группе с использованием хлорида лития, превосходил таковой в группе с ишемическим прекондиционированием практически в три раза (р<0,05) [16].

Кардиопротекторные свойства хлорида лития также подтверждены ex vivo на модели изолированных по Лангендорфу сердец крыс. Авторы обнаружили, что применение хлорида лития за 30 мин до глобальной ишемии и последующая реоксигенация уменьшают площадь инфаркта миокарда и улучшают глобальную сократительную способность миокарда [5, 20].

В другом эксперименте на модели гипертрофии миокарда кроликов R. Barillas с коллегами продемонстрировали сохранение функции сердца на близком к исходному уровню при условии добавления лития хлорида в дозе 0,1 ммоль/л к раствору для кардиоплегии [26].

Описанные эксперименты проводились на изолированных, а следовательно, денервированных сердцах животных, поэтому результаты требуют подтверждения в моделях in vivo, что и было впервые сделано в настоящем исследовании.

Результаты нашего и предшествующих исследований свидетельствуют о наличии у хлорида лития кардиопро-текторных свойств. Критическая масса доказательств, свидетельствующая о необходимости перехода к клиническим исследованиям, достигнута, необходима вторая (клиническая) фаза испытаний хлорида лития.

Заключение

Внутривенное введение хлорида лития в момент начала реперфузии оказывает кардиопротек-тивное действие на модели инфаркта миокарда у крыс, уменьшая зону инфаркта, что сопровождается практически двукратным ростом содержания фосфорилированной формы фермента киназы гликогенсинтазы-3β в миокарде.