Кишечное пищеварение и биохимия крови у кур-несушек (Gallus gallus L.) при введении в рационы микродобавки хрома

Хром относится к биогенным элементам, которые содержатся в тканях растений и животных и необходимы для нормального развития и функционирования организма. Его важнейшая биологическая роль состоит в регуляции синтеза жиров, углеводного обмена и содержания глюкозы в крови. Хром входит в состав низкомолекулярного органического комплекса — фактора толерантности к глюкозе, обеспечивающего ее нормальное содержание в крови. Он действует как регулятор количества сахара в крови (1, 2), обеспечивая нормальную активность инсулина. Хром вовлечен в регуляцию обмена холестерина (входит в состав трипсина) и служит активатором некоторых ферментов, участвуя в поддержании нормальной работы сердечной мышцы и функционирования кровеносных сосудов. Также хром способствует выведению из организма токсинов, солей тяжелых металлов, радионуклидов (3).

Биологическая активность хрома объясняется главным образом способностью ионов Сr3+ образовывать комплексные соединения. Ионы Cr3+ участвуют в стабилизации структуры нуклеиновых кислот. Хром оказывает действие на процессы кроветворения и обладает способностью активировать трипсин, поскольку входит в состав кристаллического трипсина в виде лабильного соединения, способного отщеплять ионы хрома (4). Хром проникает через кишечную стенку, причем скорость его всасывания возрастает в зависимости от концентрации, при уменьшении размеров частиц и наличии пищеварительных агентов (витамины, фитаты, аминокислоты) (5, 6).

Известно о положительном влиянии хромовых добавок при кормлении молодняка кур (7, 8). Показано (9, 10), что введение в рацион цыплят-бройлеров наночастиц хрома в дозировках 100-200 мкг/кг стимулирует обмен химических элементов. Существует противоположное мнение (1114) о том, что хром может оказывать отрицательное воздействие на организм. Поскольку реакция на определенное количество тяжелого металла разная, при введении в рацион хрома в дозировках 100 мкг/кг происходит как стимуляция, так и торможение некоторых процессов, которые напрямую зависят от его количества в корме.

В настоящей работе на курах-несушках с дуоденальной фистулой впервые показано, что при введении в рацион микродобавки хрома в пищеварительном тракте кур изменяется активность ферментов, которые по-разному реагируют на присутствие тяжелого металла в неодинаковых по ингредиентному составу кормах. При этом также изменяются биохимические показатели крови: содержание амилазы, трипсина, глюкозы, триглицеридов, общего белка, мочевой кислоты, щелочной фосфатазы.

Целью работы было изучение влияния добавки Cr2O3 на пищеварение и биохимию крови кур-несушек при ее вводе в разные по ингредиентному составу корма в микродозах (100 мкг/кг корма).

Методика. Опыты выполняли на 10 курах-несушках (Gallus gallus L.) кросса Hisex White 10-12-месячного возраста (ФНЦ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства РАН, 2018 год). Все манипуляции проводили в соответствии с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS ¹ 123, Страсбург, 1986; . Для получения содержимого 12-перстной кишки птицу оперировали, вживляя канюлю в 12-перстную кишку напротив места впадения панкреатических и желчных протоков. Хирургические операции выполняли с применением седативных и обезболивающих средств. Курицу фиксировали в левом боковом положении в специальном станке.

Разрез делали с правой стороны от последнего ребра по краю бокового отростка грудной кости на 4-5 см. Извлекали 12-перстную кишку, находили место впадения протоков в 12-перстную кишку и напротив него накладывали кисетный шов длиной 0,5-0,6 см. Внутри кисетного шва делали разрез, вставляли канюлю и затягивали кисетный шов. Тщательно обрабатывали участок вокруг вживленной канюли, при необходимости накладывали дополнительный кисетный шов. Кишечник погружали вглубь грудобрюшной полости и зашивали операционную рану узловатыми швами, захватывая все слои. После операции птица в течение 16-18 ч имела доступ к воде, но корм не получала. Через 5-7 сут после хирургической операции, когда здоровье птицы полностью восстанавливалось, приступали к физиологическим опытам.

Физиологический опыт выполняли методом групп-периодов (в каждой группе по 5 гол.), сформированных по принципу аналогов. Опыт включал два периода (по 7-10 сут каждый): в контрольный птица не получала добавку, в опытный к основному рациону добавляли ультрадисперсный препарат Cr 2 O 3 ( ООО «Платина», Россия; метод получения — плазмохимический синтез, d = 91 нм, удельная поверхность — 9 м²/г, Z-потенциал — 93±0,52 мВ, содержание Cr₂O₃ — 99,8 %) в дозе 100 мкг/кг. В первой серии опытов в состав основного рациона был включен соевый, во второй — подсолнечный жмых. Для получения достоверных результатов на каждой курице проводили не менее трех опытов по пищеварению в каждый учетный период.

Корм готовили в соответствии с зоотехническими нормами. Птица получала комбикорм по 30 г/гол. утром натощак, остальную часть скармливали в течение дня. Через 1 ч после кормления выполняли сбор дуоденального химуса (5 мл), образцы сразу центрифугировали (5 мин при 5000 об/мин) и разводили охлажденным раствором Рингера (1:10).

Активность амилазы в химусе устанавливали по гидролизу крахмала (15) с использованием фотометра КФК-3 («Загорский оптико-механический завод», Россия) при λ = 670 нм и выражали в миллиграммах расщепленного крахмала на 1 мл химуса в течение 1 мин. Липолитическую активность измеряли на полуавтоматическом биохимическом анализаторе BS-3000P с проточной кюветой («SINNOWA Medical Science & Technology Co., Ltd», Китай) с использованием набора реактивов для липазы (ООО «ДИАКОН-ВЕТ», Россия). Активность протеаз определяли по расщеплению казеина по Гаммерстену («EMD Millipore Corp., Billerica», США) с колориметрическим контролем на КФК-3 при λ = 450 нм (16).

Условия содержания и кормления кур в период экспериментов соответствовали нормам ВНИТИП (Руководство по оптимизации рецептов комбикормов для сельскохозяйственной птицы. Сергиев Посад, 2014). Корма были приготовлены на основе пшеницы и ячменя. Корм ¹ 1 содержал 812

19,4 % соевого жмыха, корм ¹ 2 — 21,4 % подсолнечного жмыха. Количество обменной энергии в кормах было одинаковым (265 ккал/100 г). Корм на основе подсолнечного жмыха содержал на 2,11 % больше сырой клетчатки и на 1,07 % — сырого жира.

Для статистической обработки результатов использовали программное обеспечение JMP Trial 14.1.0 («SAS», США) , с помощью которого рассчитывали среднее значение (M), стандартную ошибку среднего (±SEM) и корреляцию (r), определяли достоверность различий по t-критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты. Известно, что панкреатические ферменты адаптируются к качеству поступающего в организм корма (18). В наших опытах при замене в рационе кур-несушек соевого жмыха на подсолнечный наблюдалось изменение активности пищеварительных ферментов в дуоденальном химусе (табл. 1).

1. Активность пищеварительных ферментов в дуоденальном содержимом у кур-несушек ( Gallus gallus L.) кросса Hisex White при введении в рацион наночастиц оксида хрома Cr₂O₃ на фоне различных по ингредиентному составу кормов ( M ±SEM, n = 5)

Показатель	Корм ¹ 1		Корм ¹ 2
	контроль	опыт	контроль	опыт
Амилаза, мг•мл - 1•мин - 1	1426±144,8	1086±70,0	666±147,6	1747±187,3*
Липаза, Ед/л	3231±484,0	1762±187,6*	2669±144,5	4573±644,5*
Протеазы, мг•мл - 1•мин - 1	66±6,0	65±3,6	65±4,3	80±8,0*

П р и м е ч а н и е. Описание групп и кормов см. в разделе «Методика».

* Различия с соответствующим контролем статистически значимы при р < 0,05.

Активность амилазы при замене в рационе соевого жмыха на подсолнечный уменьшалась на 53,3 % (р < 0,05). При этом активность липазы и общих протеаз оставалась без изменений. Микродобавка хрома, введенная в рацион на фоне соевого жмыха, уменьшала активность амилазы на 24,0 %, липазы — на 45,5 % (р < 0,05) по сравнению с контролем (корм ¹ 1). Добавка к корму хрома на фоне подсолнечного жмыха (корм ¹ 2) приводила к повышению активность амилазы на 162,3 % (р < 0,05), липазы — на 71,4 % (р < 0,05), протеаз — на 23,1 % (р < 0,05). Следовательно, микродобавка хрома на фоне низкой ферментативной активности в кишечнике выступала стимулятором секреторной функции поджелудочной железы, а на фоне высокой — ингибировала активность липазы.

Адаптация пищеварительных ферментов к ингредиентам корма и микроэлементам отражалась на переваримости питательных веществ (табл. 2).

2. Переваримость питательных веществ у кур-несушек ( Gallus gallus L.) кросса Hisex White при введении в рацион наночастиц оксида хрома Cr₂O₃ на фоне различных по ингредиентному составу кормов ( M ±SEM, n = 5)

Переваримость, %	Корм ¹ 1		Корм ¹ 2
	контроль	опыт	контроль	опыт
Протеин	91,5±0,25	92,1±0,46	89,9±0,33*	90,7±0,25
Клетчатка	33,3±2,40	31,6±2,04	20,9±2,10*	23,1±1,78
Жир	91,2±0,38	90,4±0,34	93,4±3,10	91,3±0,47

П р и м е ч а н и е. Описание групп и кормов см. в разделе «Методика».

* Различия между контролями статистически значимы при р < 0,05.

Переваримость протеина при замене соевого жмыха на подсолнечный (контрольные периоды) снижалась на 1,5 % (р < 0,05). Количество лизина, выделяемого с пометом птицы в контроле (корм ¹ 2), превышало аналогичный показатель для корма ¹ 1 на 25,0 % (р < 0,05), содержание метионина в контрольные периоды существенно не изменялось и составля- ло 0,001±0,0002 г. Сырая клетчатка в корме, содержащем соевый жмых, переваривалась на 12,4 % лучше (р < 0,05) по сравнению с подсолнечным. Следовательно, на фоне более высокой активности пищеварительных ферментов переваримость протеина и клетчатки для соевого жмыха была выше, чем для подсолнечного. Введение в рацион наночастиц хрома не оказывало существенного влияния на переваримость питательных веществ при использовании разных белковых ингредиентов в корме.

3. Биохимические показатели плазмы крови у кур-несушек ( Gallus gallus L.) кросса Hisex White при введении в рацион наночастиц оксида хрома Cr₂O₃ на фоне различных по ингредиентному составу кормов ( M ±SEM, n = 5)

Показатель	Корм	¹ 1	Корм	¹ 2
	контроль	опыт	контроль	опыт
Амилаза, Ед/л	288±18,8	397±32,7*	271±25,0	407±35,2*
Липаза, Ед/л	58±2,8	62±7,5	61±3,0	63±0,2
Трипсин, Ед/л	202±43,7	154±16,8	95±37,9	135±53,6
Глюкоза, ммоль/л	11,3±0,40	8,3±0,51*	12,0±0,33	9,9±0,42*
Щелочная фосфатаза, Ед/л	1155±161,3	853±97,3	1293±68,8	1635±185,6
Общий белок, г/л	41,9±1,91	33,0±1,12*	42,4±1,71	38,7±2,30
Триглицериды, ммоль/л	1,8±0,30	1,4±0,21	3,6±0,40	4,3±0,40
Мочевая кислота, ммоль/л	245±34,7	182±19,1	233±21,1	180±16,2
Аланинаминотрансфераза, Ед/л	7,7±0,91	5,4±0,53*	7,9±0,54	7,5±0,91
Аспартатаминотрансфераза, Ед/л	197,2±8,81	118,3±16,63*	211,2±6,65	190,2±11,21

П р и м еч а ни е. Описание групп и кормов см. в разделе «Методика».

* Различия с соответствующим контролем статистически значимы при р < 0,05.

Полученные нами ранее данные свидетельствуют об изменении активности пищеварительных ферментов в плазме крови у мясных кур при включении в рацион различных биопрепаратов (19). В этом опытах биохимические показатели крови у птицы не имели существенных различий при использовании неодинаковых по ингредиентному составу кормов. Исключением были триглицериды, количество которых оказалось в 2 раза выше в варианте с кормом ¹ 2 по сравнению с кормом ¹ 1 (табл. 3), что указывает на лучшее усвоение жира при одинаковой активности липазы в дуоденальном содержимом. При добавлении хрома на фоне соевой белковой добавки наблюдалось увеличение активности амилазы в плазме крови на 37,8 % (р < 0,05), остальные показатели имели тенденцию к снижению по сравнению с контролем: по трипсину — на 23,8 % (р < 0,05), глюкозе — на 26,3 % (р < 0,05), щелочной фосфатазе — на 26,1 % (р < 0,05), общему белку — на 21,4 % (р < 0,05), триглицеридам — на 22,2 % (р < 0,05), мочевой кислоте — на 25,7 % (р < 0,05), аланинаминотрансферазе (АлАТ) — на 29,9 % (р < 0,05), аспартатаминотрансферазе (АсАТ) — на 40,1 % (р < 0,05). При использовании микродобавки хрома на фоне рациона с подсолнечным жмыхом активность амилазы увеличивалась на 50,1 % при одновременном снижении глюкозы на 17,2 % (р < 0,05).

Мы установили зависимость между активностью амилазы в дуоденальном химусе и содержанием глюкозы: чем выше активность фермента, тем меньше глюкозы содержалось в крови (рис. 1). Если корреляция в контроле не была достоверной, то в опыте коэффициент корреляции между активностью амилазы в дуоденальном химусе и содержанием глюкозы в крови оставался устойчиво отрицательным: в варианте с кормом ¹ 1 r = - 0,72 (р < 0,05), с кормом ¹ 2 — r = - 0,45. Это позволяет заключить, что хром существенно влияет на углеводный обмен благодаря лучшему использованию глюкозы организмом. Известно, что хром регулирует гомеостаз глюкозы, активируя рецепторы инсулина, тем самым усиливая передачу сигнала и увеличивая чувствительность к инсулину (20-22).

Триглицериды — это сложные эфиры, которые служат основными составляющими жира у всех живых организмов. Попадая в кишечник вме-814

Рис. 1. Содержание глюкозы (ммоль/л) (а) и активность амилазы в плазме крови (Ед/л) (в), активность амилазы и дуоденальном содержимом (мг•мл ^{- 1} •мин ^{- 1} ) (б) у кур-несушек ( Gallus gallus L.) кросса Hisex White при введении в рацион наночастиц оксида хрома Cr 2 O 3 на фоне различных по ингредиентному составу кормов: 1 — контроль (корм ¹ 1), 2 — опыт (корм ¹ 1), 3 — контроль (корм ¹ 2), 4 — опыт (корм ¹ 2). Описание групп и кормов см. в разделе «Методика». Показатели содержания глюкозы увеличены в 10 раз.

сте с пищей, триглицериды подвергаются расщеплению липазой желудочного сока и поджелудочной железы на глицерин и жирные кислоты (23), однако вопросы жирового обмена в организме птицы до конца не изучены (24). По нашим данным, при увеличении активности липазы в химусе повышалось количество триглицеридов в плазме крови (рис. 2).

Величина липазно-жирового соотношения в плазме крови при использовании в рационе кур-несушек корма с соевой добавкой почти в 2 раза превышала показатели контроля с добавкой подсолнечного жмыха. Прямая зависимость наблюдалась между активностью липазы в дуоденальном химусе и триглицеридами, то есть чем лучше проходил гидролиз жиров в кишечнике, тем больше липидов поступало в кровь (коэффициент корреляции r колебался от 0,42 до 0,63; р < 0,05). Микродобавка хрома усиливала эти процессы, улучшая усвоение жиров организмом.

Рис. 2. Содержание триглицеридов (ммоль/л) (а) , активность липазы (Ед/л) (в) и щелочной фосфатазы (Ед/л) (г) в плазме крови, активность липазы в дуоденальном содержимом (Ед/л) (б) у кур-несушек ( Gallus gallus L.) кросса Hisex White при введении в рацион наночастиц оксида хрома Cr₂O₃ на фоне различных по ингредиентному составу кормов: 1 — контроль (корм ¹ 1), 2 — опыт (корм ¹ 1), 3 — контроль (корм ¹ 2), 4 — опыт (корм ¹ 2). Описание групп и кормов см. в разделе «Методика». Показатели содержания триглицеридов увеличены в 100 раз, липазы в крови — в 10 раз.

Активность щелочной фосфатазы, которая секретируется в печени, зависит от содержания липазы в дуоденальном химусе (25). Мы обнаружили зависимость между активностью липазы в дуоденальном содержимом и активностью щелочной фосфатазы в плазме крови (см. рис. 2). Обратная связь между этими по- казателями в некоторых случаях оказалась сильной (значение r = -0,90, р < 0,05).

Общий белок в плазме крови — это относительно стабильный показатель у здоровых животных, его колебания могут быть связаны с низким содержанием протеина в корме или с заболеванием. Белки крови в основном представлены альбуминами, которые обеспечивают поддержание онкотического давления крови. В нашем опыте уменьшение содержания общего белка в пределах физиологической нормы было связано с введением в корм микродобавки хрома (рис. 3). Одновременно с этим изменялось количество мочевой кислоты в крови и активность АлАТ, что указывает на нормализацию функции печени и поджелудочной железы (26).

Рис. 3. Активность трипсина (Ед/л) (а) , содержание общего белка (г/л) (в) , активность аланинаминотрансферазы (Ед/л) (г) , аспартатаминотрансферазы (Ед/л) (д) в крови и активность протеаз (мг•мл ^{- 1} •мин ^{- 1} ) (б) в дуоденальном содержимом у кур-несушек ( Gallus gallus L.) кросса Hisex White при введении в рацион наночастиц оксида хрома Cr 2 O 3 на фоне различных по ингредиентному составу кормов: 1 — контроль (корм ¹ 1), 2 — опыт (корм ¹ 1), 3 — контроль (корм ¹ 2), 4 — опыт (корм ¹ 2). Описание групп и кормов см. в разделе «Методика». Показатели содержания аланинаминотрансферазы увеличены в 10 раз.

Анализ содержания ферментов в крови широко используется в медицине для оценки состояния сердца и печени. Фернандо Де Ритис (Fernando De Ritis) в 1957 году установил, что важное значение имеет не только собственно активность АлАТ и АсАТ в сыворотке крови, но и их соотношение (коэффициент де Ритиса). Колебания этого показателя у человека находятся в диапазоне от 1 до 2. У подопытных кур его значение было чрезвычайно высоким — 21,8-26,7. Возможно, следует отказаться от расчета коэффициента де Ритиса для кур, но отметим, что выполненный нами корреляционный анализ показал прямую и достаточно устойчивую связь между АсАТ и АлАТ, для которой величина r достигала 0,98 (р < 0,05). При добавлении наночастиц оксида хрома коэффициент де Ритиса незначительно снижался в опытных группах по сравнению с контролем. В отличие от тканевых, панкреатические ферменты гидролизуют белки, жиры и углеводы в желудочно-кишечном тракте до мономеров, а затем поступают в кровь, где участвуют в регуляции метаболизма. Из литературы известно (27), что существует прямая зависимость между активностью трипсина в крови и количеством глюкозы: чем больше трипсина в крови, тем выше содержание глюкозы. Эта закономерность была подтверждена нами в исследованиях на птице в постпрандиальный период (28).

Наши экспериментальные данные также согласуются с результатами исследований (1, 2), в которых показано, что хром регулирует гомеостаз глюкозы в крови, активируя рецепторы инсулина и тем самым, как уже отмечалось, модулирует сигнальную трансдукцию и повышает чувствительность к инсулину (29, 30). Что касается липидного обмена, то мы, в отличие от А.А. Оганяна с соавт. (3), не обнаружили достоверного влияния микродобавки хрома на концентрацию триглицеридов в крови. Однако нами установлено, что микродобавка хрома при низкой ферментативной активности в кишечнике выступает стимулятором активности дуоденальных ферментов, а при высокой — ингибирует активность липазы. Следовательно, есть основания полагать, что при низкой ферментативной активности добавка хрома оказывает положительное влияние на липидный обмен. В белковом обмене при добавлении в корм Cr 2 O 3 мы отмечали некоторые изменения: общий белок снижался в пределах физиологической нормы (на 24,1 %) при содержании кур на рационе с добавкой соевого жмыха, активность протеаз увеличивалась на 23,1 % при использовании в рацион подсолнечного жмыха, но при этом переваримость сырого протеина существенно не изменялась.

В опытах на крысах (31) сравнительный анализ использования раз- ных форм хрома в рационе показал, что активность амилазы в поджелудочной железе увеличивается при дозе наночастиц оксида хрома 300 мкг/кг. Включение пиколината хрома (CrРic) в аналогичной дозировке в корм крыс стимулирует активность липазы и протеазы. Увеличенная доза (500 мкг/кг) CrCl3 и CrРic уменьшает активность липазы в 12-перстной кишке и снижает активность амилазы и липазы в плазме крови, что свидетельствует о депрессирующем влиянии высоких доз хрома на энтеропанкреатическую циркуляцию пищеварительных ферментов и нарушении обмена Mg и Fe в крови. Количество триглицеридов снижается при максимальных дозах хрома в форме хлорида и пиколината, что подтверждает их участие в липидном обмене. Кроме того, на крысах установлено значительное увеличение частоты повреждений ДНК в лейкоцитах периферической крови и печени после воздействия оксида хрома в дозах 300 и 1000 мг/кг (32).

Результаты, полученные нами на курах, согласуются с описанием действия оксида хрома в форме наночастиц на крыс. Преимущество наших экспериментов состоит в том, что мы впервые изучили влияние оксида хрома в опытах in vivo на канюлированных курах на фоне разных белковых добавок.

Таким образом, у кур-несушек кросса Hisex White микродобавка хрома на фоне разных белковых компонентов рациона оказывает неоднозначное действие. В опытный период, независимо от рациона, при введении добавки оксида хрома отмечается повышение активности амилазы в крови на 37,8-50,2 % (р < 0,05), при этом содержание глюкозы в базальный период снижается на 26,6-17,5 % (р < 0,05), что свидетельствует об улучшении усвоения глюкозы. Установлена связь между активностью амилазы в дуоденальном содержимом и количеством глюкозы в крови: коэффициенты корреляции в опытный период на разных рационах — - 0,72 (р < 0,05) и - 0,45. При содержании птицы на пшеничном рационе с добавкой соевого жмыха введение оксида хрома способствует снижению активности липазы в содержимом кишечника, при этом биохимические показатели крови кур-несушек уменьшаются на 22-40 % (р < 0,05) в пределах физиологической нормы. Введение оксида хрома на фоне подсолнечного жмыха способствует повышению активности амилазы, липазы и протеаз в дуоденуме, что связано, по-видимому, с содержанием антипита-тельных веществ в подсолнечном жмыхе. Это указывает на роль базового рациона в действии оксида хрома на организм птицы.