Клеточная гибель Р-эндокриноцитов панкреатических островков, обусловленная аллоксановой цитотоксичностью

Селективную деструкцию β-клеток панкреатических островков вызывают некоторые химические вещества хлорозотоцин, аллоксан, стрептозо-тоцин, ципрогептадин. Наиболее широкое применение для моделирования сахарного диабета у животных получили аллоксан и стрептозотоцин [6]. Данные вещества повреждают β-клетки человека и лабораторных животных (мыши, крысы, собаки) [7]. Моделирование различных по тяжести состояний нарушения углеводного обмена (явный сахарный диабет различной формы: инсулинозависимый и инсулинонезависимый, нарушенная толерантность к углеводам или скрытый диабет) зависит от применяемой в эксперименте дозы цитотоксинов.

Повреждающее действие β-цитотоксинов осуществляется посредством нескольких механизмов: формирование разрывов ДНК с последующей активизацией поли-АДФ-рибозо-синтетазы; угнетение активного транспорта кальция и кальмодулинак-тивированной протеинкиназы; генерация свободных радикалов кислорода, нарушающих эндогенные процессы защитной функции клетки.

Однако, несмотря на то, что аллоксан имеет многолетнюю историю применения, некоторые механизмы клеточного повреждения, обусловленного его введением, изучены не в полном объёме.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Уточнение механизмов клеточной гибели β-эн-докриноцитов панкреатических островков при введении аллоксана.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводили на 20 белых крысах-самцах массой 300—340 г., разделенных на две группы. Животным опытной группы осуществляли однократную внутрибрюшинную инъекцию аллоксана в дозе 120 мг/кг. Контролем являлись интактные крысы, содержавшиеся в стандартных условиях вивария. Протокол экспериментальной части исследования согласован с Региональным этическим комитетом (решение № 43, 2006). Спустя 7 дней животных выводили из эксперимента, изготавливали микропрепараты поджелудочной железы по общепринятым гистологическим методикам с последующей окраской гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование выполняли на базе лаборатории морфологии и иммуногистохимии отдела общей и экспериментальной патологии Волгоградского научного центра РАМН. Были использованы моноклональные антитела к каспазе 3 (клон JHM62), протеину MDM2 (клон 1B10), NO-синтазе-3 (клон RN5), TNF-апоптоз индуцирующему лиганду (TRAIL, клон 27B12) (Novocastra, Великобритания) и белку Bcl-2 (клон sc-7382, Santa Cruz, США) и поликлональных антител к белкам p53 (DakoCytomation, Дания) и Bax (BD Pharmingen, США). Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В группе интактных животных поджелудочная железа имела классическое гистологическое строение: дольки альвеолярно-трубчатого строения, разделенные тонкими прослойками соединительной ткани. Вблизи выводных протоков располагались островки Лангерганса. При иммуногистохимическом исследовании эндокриноциты панкреатических островков были негативны к окрашиванию на белки

NO-синтаза-3, TRAIL, p53 и Bax. Единичные слабо Bcl-2-позитивные эндокриноциты располагались в центральных отделах островков. Большинство клеток островков Лангерганса имели позитивную ядер-ную окраску к протеину MDM2.

В группе животных с аллоксан-индуцирован-ным сахарным диабетом отмечался отек междольковой соединительной ткани и полнокровие кровеносных капилляров поджелудочной железы. Определялся умеренный коллапс панкреатических островков. В эндокриноцитах, расположенных в центральных отделах островков, отмечались признаки деструкции. Наблюдалось негативное иммуногистохимическое окрашивание β-клеток к белкам p53, TRAIL и NO-синтазе-3. Слабо позитивно окрашивалась цитоплазма к протеину Bcl-2. Экспрессия белков каспазы 3 и Bax была умеренной в большинстве β-эндокриноцитов. В незначительной части клеток (расположенных преимущественно в периферических отделах островков Лангерганса) отмечалось умеренное ядерное окрашивание к белку MDM2.

Известно, что повреждение ДНК β-клеток панкреатических островков обусловлено избирательной цитотоксичностью аллоксана за счет образования активных форм кислорода и перекиси водорода, что приводит к окислению SH-групп белков. Открытым остается вопрос об участии оксида азота (NO) в цитотоксическом эффекте аллоксана, так как при низких концентрациях NO в β-клетках ингибируются индуцибельные формы NO-синтазы и уменьшается повреждение ДНК [3].

Важным аспектом аллоксановой цитотоксичности является нарушение интрацеллюлярного гомеостаза кальция. В экспериментах in vitro и in vivo подтверждено увеличение концентрации цитоплазматического кальция в клетках панкреатических островков при аллоксановом диабете. Избыточное поступление кальция из внеклеточной жидкости и его мобилизация из внутриклеточных депо обусловлена деполяризацией клеточных мембран и мембран митохондрий β-клеток [2, 7]. Грубое повреждение внутриклеточных структур свободными радикалами, окисление SH-групп белков и нарушение внутриклеточного гомеостаза кальция сопровождается развитием некроза.

Однако существует и другой механизм гибели β-клеток — апоптоз. Одним из пусковых факторов апоптоза в результате действия сильных окислителей является повреждение ДНК или внутриклеточных мембран митохондрий. Ключевое положение в реализации механизмов клеточной гибели занимает белок р53 и семейство цитоплазматических протеаз — каспаз. Белок р53 является ключевым звеном в развитии апоптоза, однако существуют механизмы запрограммированной кле- точной гибели без участия данного белка (механизм действия фактора некроза опухоли). Белок MDM2 является антиапоптогеном и предохраняет клетку от запрограммированной гибели путем ингибирования синтеза протеина р53 и ускорения его распад в цитозоле [1].

Семейство каспаз образует разветвленный каскад, взаимно активирующий друг друга [8]. Активация каспазного каскада возможна с помощью сигнала, полученного от цитолеммы (каспаза 8), или в результате митохондриальных факторов (каспаза 9). Каспазы 8 и 9 активируют эффекторную каспазу 3, после чего процесс клеточной смерти оказывается необратимым [4].

Однако активация апоптоза возможна и без участия каспазного каскада. Гиперэкспрессия белка-промотора апоптоза Вах приводит к дестабилизации мембран митохондрий и индуцирует апоптоз. Проницаемость мембран митохондрий для кальция регулируется белками семейства Bcl-2/Bax. Протеин Bcl-2 оказывает ингибирующее действие на апоптоз за счёт снижения проницаемости мембран, а Bax наоборот активирует апоптоз, так как увеличивает проницаемость. Таким образом, митохондриальная ветвь апоптоза может активироваться протеином Bax с дальнейшей активацией только эффекторной каспазы-3 [5].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, реализация цитотоксического эффекта аллоксана происходит за счёт развития двух процессов: некроза и апоптоза. Действие свободных радикалов и окисление SH-групп белков приводит к грубому деструктивному процессу — некрозу, а апоптоз активируется за счёт нарушения гомеостаза кальция и дестабилизации мембран митохондрий с последующей активацией каспазного каскада без участия белка р53.