Клеточные реакции слизистой оболочки органов интестинальной системы после уранового инкорпорирования

Воронцова З.А., Кудаева Э.Ф. Клеточные реакции слизистой оболочки органов интестинальной системы после уранового инкорпорирования. Морфологические ведомости. 2020;28(1):9-15. (1):9-15

Vorontsova ZA, Kudaeva EF. Cellular reactions of the mucous membrane of the intestinal system after uranium incorporation – Morphological Newsletter. 2020;28(1):9-15. (1):9-15

Введение. Исследование адаптивных возможностей организма к различным неблагоприятным условиям с учетом отдаленных сроков возможных обратимых процессов является актуальной научной проблемой. Загрязнение окружающей среды в результате возникновения открытых радионуклидных источников определяет вероятность детерминирования его стахостических эффектов. Радионуклиды ряда уран-238 составляют 99% всего природного урана. Опасность инкорпорирования обедненного урана (далее - ОУ) связана с широким практическим применением в военной промышленности при производстве снарядов и в условиях вооруженных конфликтов со стойкими последствиями загрязнения территорий, с его высокой дисперсностью и попаданием во внутреннюю среду организма человека с водой, что является наиболее опасным. По литературным данным отмечено изменение поведенческих реакций, коррелирующее с уровнем окисления липидов в головном мозге и степенью пораженности экспериментальных животных, о которых имеются разноречивые данные [1]. Вопрос о возможности приспособительных реакций на инкорпорирование ОУ остается открытым [2]. Органы интестинальной системы можно считать органами-мишенями [3]. Кишечный эпителий по мощности ферментативных систем, детоксикации и биотрансформации субстратов является крупным барьером на пути чужеродных и токсических веществ из просвета кишки во внутреннюю среду организма. Одной из ключевых характеристик поражаемости и сигналом к активации интестинальной системы после инкорпорирования водного раствора оксидов ОУ можно считать классическую цепочку иммунных реакций с участием основных клеток – лимфоцитов, которые эллиминируют клетки-мишени, определяя степень иммуногенности и иммунотропности. Взаимосвязанные реакции клеток врожденного и приобретенного иммунитета инициируются и регулируются посредством активирующих и ингибирующих рецепторных комплексов для антигенов, выделяемых иммунными и вспомогательными клетками [4, 5]. Выявление особенностей иммунного статуса органов-мишеней интестинальной системы позволит разработать алгоритм профилактических и лечебных мероприятий, способствующих улучшению качества жизни [6], а изменение динамики компонентов кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани - выявить иммунологический статус органа, его ответную иммунную реакцию на поражение.

Цель исследования – выявить последствия воздействия инкорпорированного обедненного урана в реакциях клеточных компонентов слизистой оболочки интестинальной системы.

Материалы и методы исследования . Исследование выполнено на лабораторных половозрелых крысах-самцах в количестве 180 с начальным возрастом четыре месяца. Из них 30 животных были контрольные, остальные распределены на три группы по 50 животных, испытавших однократный пероральный прием водного раствора оксидов ОУ вместо воды в дозе 0,01 мг на 100 г массы и исследованных спустя один, три и шесть месяцев от начала эксперимента. Эксперимент проведен в соответствии с Приложением 4 к приказу № 755 Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 и Европейской конвенцией о защите животных, используемых в эксперименте (Директива 86/609 ЕС). После декапитации и извлечения проксимальных фрагментов тощей и толстой кишок их фиксировали и замораживали в твердой углекислоте. В качестве фиксаторов были использованы 10% нейтральный формалин и раствор Карнуа, с последующей гистологической обработкой материала и заливкой в Killik и гомогенизированную парафиновую среду Histomix. На изготовленных криостатных (криостат Cryo-Cut II Microtome 1600 Reichert-jung, Австрия) и микротомных (микротом C. Reichert Wien № 5752, Австрия) срезах были проведены гистохимические (глюкозо-6-фосфатдегидрогенза - Г-6-ФДГ, щелочная фосфатаза - ЩФ), иммуногистохимические (Ki67, Bcl2) – (рис. 1, 2), и общегистологические (гематоксилин-эозин) методы окраски. Специальные методы окраски были использованы для выявления тучных клеток (далее - ТК) при окраске основным коричневым по Шубичу. Плазмоциты окрашивали метиленовым синим; клетки Панета (далее - КП) были выявлены ШИК-реакцией (рис. 3).

Рис. 1.

Иммуногистохимическая

Рис. 2.

Иммуногистохимическая

Рис. 3.

реакция на маркер пролиферации Ki67 в эпителиоцитах крипт тощей кишки.

Ув.: 400.

реакция на антиапоптотический белок Bcl2 в энтероцитах ворсинки тощей кишки. Ув.: 400.

Клетки Панета крипт тощей кишки. ШИК-реакция.

Ув.: 400.

Результаты исследования и обсуждение. Количественные показатели клеточных компонентов выявили динамичность изменений, что определило их чувствительность к эндогенному воздействию инкорпорированного водного раствора оксидов ОУ на фоне долговременного нарушения метаболического гомеостаза с дисгармонией функций ферментов, являющихся пусковой причиной нарушений. Использованный в работе иерархический метод кластеризации по критериям близости объектов, имеющих подобные морфометрические показатели на основе предварительного сравнения, определили ближайшие по характеристике исследуемые группы из исходного множества. Обоснованием к проведению кластерного анализа являлось использование большого количества крыс в экспериментальных группах с целью исключения фактора случайных изменений. По показателям средних значений оптической плотности фермента щелочной фосфатазы в области щеточной каемки и Г-6-ФДГ в цитоплазме энтероцитов определили степень их близости с контрольными показателями и между собой, а также внутри кластера. Проведенный кластерный анализ выявил гетерогенность распределения крыс по морфометрическим показателям в кластерах, определяющих диссонанс процессов функционирования, а также признаки некоторого единообразия (табл. 1). Спустя месяц (табл. 2) оптическая плотность ЩФ повышалась в кластерах II и III и снижалась в кластере I, составляющем половину исследуемых животных данного срока наблюдения. Оптическая плотность Г-6-ФДГ повышалась в кластерах I и II и снижалась в кластере III, включающем пять особей из 50 исследуемых. Через три месяца оптическая плотность ЩФ была выше контрольных показателей во всех кластера. Оптическая плотность Г-6-ФДГ была достоверно снижена в кластерах I и III предположительно из-за возникновения окислительного стресса [9]. Динамика оптической плотности ЩФ спустя шесть месяцев характеризовалась снижением в кластерах I и II, но повышалась в кластере III, содержащем наименьшее количество животных. Оптическая плотность Г-6-ФДГ была выше в кластерах I и III, а в кластере II оставалась на уровне контроля (табл. 2). Изменение клеточного метаболизма привело к нарушению клеточных ферментно-транспортных систем и способствовало запуску каскада протективных клеточных реакций.

Таблица 1 Распределение числа животных в кластерах в зависимости от исследуемого фермента в тощей кишке

кластеры	I		II		III
критерии месяцы	ЩФ	Г-6-ФДГ	ЩФ	Г-6-ФДГ	ЩФ	Г-6-ФДГ
1	26	24	20	21	4	5
3	31	24	18	21	1	5
6	27	26	18	21	5	3

Таблица 2

Количественные показатели оптической плотности распределения ферментов в

Месяцы кластеры I II III критерии ЩФ Г-6-ФДГ ЩФ Г-6-ФДГ ЩФ Г-6-ФДГ 1 К*-ЩФ К*-Г- 6-ФДГ ОУ* ОУ* ОУ* ОУ* ОУ* ОУ* 446,1 276,5 402,8 307,4 467,6 371,2 533,7 231,2 3 334,0 255,3 466,4 240,3 450,3 317,7 601,1 143,6 6 327,3 214,8 322,4 268,7 252,3 213,9 334,3 327,2 условных единицах в эпителии тощей кишки

Примечание: K* – контроль, ОУ* – обедненный уран

Маркером неблагополучного состояния слизистой оболочки органов интестинальной системы можно считать инфильтрацию эпителия лимфоцитами. Топографическая разнородность интраэпителиальных лимфоцитов (далее - ИЛ) имеет особую функциональную значимость, она создает при взаимодействии с эпителиоцитами специфическое микроокружение для презентации и распознавания антигенов, проникших в эпителиальный пласт [10-11].

Анализ топографии малых ИЛ в ворсинках тощей кишки на уровне эпителия с учетом полярности энтероцитов показал, что они не изменяли локализацию по сравнению с контрольными препаратами спустя месяц, однако, было отмечено возрастание их численности (p<0,05). Через три месяца сохранялась аналогичная полярность, но уменьшалась численность ИЛ (p<0,05). Спустя шесть месяцев независимо от топографии численность апикальных и базальных ИЛ была достоверно ниже контрольных показателей, что способствовало снижению их общего числа (p<0,05). Таким образом, в процессе миграции динамика количества ИЛ топографически проявлялась относительно пласта энтероцитов и изменялась с достоверным уменьшением их числа спустя три и шесть месяцев и повышалась по сравнению с контролем через месяц (p<0,05).

Можно констатировать, что ИЛ перемещались от базальной мембраны к щеточной каемке в горизонтальной плоскости и вместе с эпителием в процессе физиологического обновления – по вертикали. Их можно было также обнаружить в зоне десквамирующих энтероцитов. Это характеризует особенности неравномерного перераспределения ИЛ на фоне нестабильности ферментов определяющих поражаемость эпителия. В проведенных реакциях с использованием соответствующих моноклональных антител для выявления универсального маркера пролиферации Ki67 в эпителиоцитах крипт было отмечено достоверное повышение их числа через три и шесть месяцев и незначительное снижение спустя один месяц после воздействия ОУ. Выявлена некоторая закономерность повышения общего числа интраэпителиальных малых лимфоцитов спустя один месяц, при которой число Ki67+-клеток снижалось и достоверно повышалось на фоне снижения ИЛ через три и шесть месяцев. Их участие в регуляции пролиферации подтверждает гипотезу, согласно которой лимфоидная ткань является специфическим регулятором восстановительных процессов [12].

Кинетика обновления в системе «ворсинка-крипта» осуществлялась по пути восполнения утраченных эпителиоцитов [13]. Спустя один месяц число Bcl2+-клеток было достоверно выше относительно контроля, а Ki67+-клеток ниже контрольных показателей (р<0,05). В последующие сроки был отмечен инверсивный характер изменений. Наблюдалось преобразование малодифференцированных клеток в специализированные клетки Панета (далее - КП) спустя три месяца, которым отводится важное место в обеспечении врожденной защиты кишки [14]. КП с мелкими гранулами были расположены в зоне малодифференцированных клеток, с очень крупными гранулами лежали в донном отделе крипты и их гранулы занимали всю надъядерную цитоплазму, что очень важно для обеспечения нормального состояния иммунной защиты [15, 16]. Учитывая роль КП в поддержании недифференцированного стволового состояния и пролиферативной активности эпителия [17] можно констатировать согласованный выраженный эффект, характеризующийся повышением Ki67+-клеток на фоне гиперплазии КП, определяющих продолжительный характер процессов восстановления. Учитывая снижение показателей антиапоптотического белка Всl2, предотвращающего окислительное повреждение клеточных мембран [11], коррелирующее с повышением митотических клеток в функциональной системе «ворсинка-крипта», можно предположить мобилизацию защитных механизмов слизистой оболочки тощей кишки, как ответную реакцию, на возникший окислительный стресс спустя три месяца в условиях эксперимента.

В индукции иммунного ответа была учтена реакция ТК стромы, определяющая динамичность пролиферации лимфоцитов и их трансформацию в плазматические клетки с эффектами обратной связи [18]. Во все сроки эксперимента независимо от продолжительности наблюдения после однократного инкорпорирования ОУ отмечены количественные и качественные изменения ТК. Спустя месяц возрастало число дегранулированных ТК за счет снижения вакуолизированных с формированием сильной достоверной корреляции. Через три месяца коэффициент корреляции имел средние показатели при возрастании числа недегранулированных ТК в состоянии покоя. Шесть месяцев спустя сильные положительные связи были между числом всех типов ТК, активные формы – дегранулированные и вакуолизированные ТК, перераспределялись за счет возрастания числа дегранулированных при снижении вакуолизированных и недегранулированных форм (p<0,05). Таким образом, чувствительность ТК была избирательной и зависела от отдаленности сроков наблюдения, что определило модификацию биоэффектов ОУ изменением числа их морфофункциональных типов и сменой характера высвобождения биологически активных веществ, способствующих активизации компенсаторно-приспособительных реакций на уровне местного гомеостаза как адаптационного синдрома, определяющего локальный ответ на воздействие ОУ [19, 20]. Выявленные количественные показатели динамичности реакции на Всl2 антигенпредставляющих стромальных клеток проявлялись разнонаправленными эффектами. Число плазматических клеток достоверно возрастало по всем отдаленным срокам после воздействия ОУ, спустя три месяца оно в 2,5 раза превышало показатели контроля. Число макрофагов стромы независимо от сроков наблюдения было достоверно ниже контрольных показателей, спустя три месяца - в 2,5 раза.

Таким образом, динамика активности лимфоцитов, инфильтрирующих эпителиальный пласт как очаг поражения, и плазмоцитоз, индуцированный активностью ТК с преобладанием процесса дегрануляции, определили состоятельность защитных реакций и, в целом, иммунного ответа слизистой оболочки тощей кишки на пролонгацию однократного воздействия ОУ.

Исследование состояния системы проницаемости микроциркуляторного русла является важной характеристикой в оценке степени чувствительности метаболических и обменных процессов. Динамичность изменений исследуемых критериев в слизистой оболочке толстой кишки имела разнородный характер реагирования или не испытывала чувствительности. Независимо от отдаленности сроков наблюдалось достоверное снижение оптической плотности ЩФ, эквивалентной проницаемости капиллярного русла. Показатели оптической плотности Г-6-ФДГ варьировали, достоверно возрастая спустя месяц, снижаясь спустя шесть месяцев, а через три месяца они были на уровне контроля. Несмотря на дестабилизацию метаболических процессов, число ИЛ через один и три месяца оставалось без изменений, а спустя шесть месяцев было достоверно снижено. Во все экспериментальные сроки число Ki67+-клеток было выше контрольных показателей, однако лишь спустя три месяца после воздействия ОУ они были достоверными. Биоэффекты ОУ были нестабильным и избирательными в зависимости от отдаленности сроков наблюдения без определенных закономерностей, предполагая большую защищенность слизистой оболочки толстой кишки.

Заключение. Фактический материал, приведенный в работе, позволяет говорить о существовании гомеостатической иммунной реакции в слизистой оболочке тонкой и толстой кишки, контролирующей пролиферацию клеток, как особой формы иммунного надзора за состоянием цитодифференцировки. Морфологические и биохимические изменения клеток и тканей являются главным ориентиром в диагностике начальных стадий развития патологических процессов, а разработанные на их основе иммунопрофилактические подходы обеспечат нормальное функционирование органов и системы в целом.

Авторы сообщают об отсутствии каких-либо конфликтов интересов при планировании, выполнении, финансировании и использовании результатов настоящего исследования.