Clinical evaluation of a hydrogel well covering with the complex of natural antimicrobe peptides FLIP7 and allantoin in dermal burns

Соблюдение правил асептики является основополагающими элементами хирургической деятельности. Предупреждение контаминации раны патогенной микрофлорой способствует ускорению процессов её заживления и снижению частоты инфекционных осложнений. Одним их основателей асептики является немецкий хирург Эрнст фон Бергманн, который в 1890 г. предложил различные механические способы стерилизации [1]. Впервые стерилизованные повязки при операциях были применены Н.В. Склифосовским ещё в 1880 г. [2]. В реальных условиях стерильную рану мы можем наблюдать только во время проведения ряда плановых хирургических вмешательств. Во всех остальных случаях специалисты сталкиваются в своей практике с инфицированными дефектами различного уровня контаминации.

Ожоги — одно из самых распространённых в мире травматических поражений. По оценкам ВОЗ, ежегодно в мире происходит до 180 000 случаев смерти, вызванных ожогами. Особенность ожоговой раны — разрушение структуры покровных тканей (кожи) [3]. Это во многом определяет тяжесть травмы и неизбежность инфицирования, а присутствие в ране клеточного детрита и хорошая аэрация формируют среду, благоприятную для развития бактерий [4]. Поиск средств для местного лечения, позволяющих не только эффективно элиминировать патогенную микрофлору, но и стимулировать заживление является актуальной задачей медицины [5].

В настоящее время с этой целью активно применяются галогены и галогенсодержащие соединения (повидон-йод, йодинол хлоргексидин), окислители (перекись водорода), кислоты и щелочи (борная кислота), соли металлов (нитрат серебра), детергенты (мирамистин) и т.д.

Препараты йода эффективны в отношении большинства микроорганизмов, к ним не развивается резистентность, однако антимикробная активность сохраняется лишь в течение 30 минут, а также имеется риск развития сенсибилизации и нежелательных неаллергических явлений. Соединения серебра способны подавлять патогенную микрофлору в области инфицированного раневого дефекта более длительное время (более суток), однако, по сравнению с предыдущей группой, к серебросодержащим препаратам возможно развитие резистентности. Необходимо отметить, что йодо- и серебросодержащие препараты, а также окислители могут оказывать ингибирующее (цитотоксическое) воздействие на процесс репаративной регенерации. Хлоргексидин, относящийся к галогенам, является одним из наиболее известных и активно применяющихся антисептических препаратов как в быту, так и медицинских учреждениях. Однако к его достоинствам можно отнести только отсутствие влияния на процесс заживления. Длительность антимикробного эффекта нестабильна (в пределах от трех до 10 часов), доказана возможность развития аллергических/неаллер-гических нежелательных реакция, а глубина воздействия ограничена поверхностными белками [6].

Активное применение антисептиков и антибиотиков при лечении инфицированных ожогов способствует развитию устойчивости патогенной микрофлоры. Особую роль при этом играет образование микробным сообществом раны биоплёнок [7]. Согласно исследованиям, последние способствуют снижению, а иногда и полной потере эффективности антибиотических препаратов и антисептиков. В настоящее время ведётся активный поиск средств, препятствующих переходу бактерий к этой форме устойчивости.

Одним из возможных путей решения проблемы выбора средства для местного лечения инфицированных ран и ожогов, в т.ч. способного активно ингибировать процесс формирования биопленок, является применение препаратов на основе природных антимикробных пептидов (дефензины, цекропины, диптерицины и тд.), в частности гидрогелевого раневого покрытия основе белкового комплекса FLIP7. В его состав также входит аллантоин (продукт метаболизма пуринов у млекопитающих — стимулятор заживления, анальгетик) и карбопол — редкосшитый сополимер акриловой кислоты, который является гелеобразующим агентом данного изделия [8]. Электростатическое взаимодействие положительно заряженных групп катионных пептидов FLIP7 и отрицательно заряженных групп карбопола создает интегрированное раневое покрытие, которое обеспечивает механическую защиту поврежденной поверхности и оптимальный микроклимат для активной репаративной регенерации, а также подавляет патогенную микрофлору.

Основным действующим веществом гидрогелевого покрытия является комплекс FLIP7, содержащий пептиды природного происхождения: дефензины, цекропины, диптерицины, пролин-богатые пептиды. Он обладает широким спектром антибактериальной активности, эффективен в отношении многих штаммов с приобретенной и природной устойчивостью к антибиотикам. Помимо прямого бактерицидного действия, FLIP7 разрушает защитный матрикс бактериальной биопленки, обеспечивая прямой доступ лекарственных веществ и фагоцитов к микроорганизмам [9]. При этом восстанавливается эффективность антибиотиков, теряющих активность при переходе микроорганизмов в состояние биологической пленки [10]. Доказано, что бактерии не вырабатывают устойчивость к компонентам FLIP7 [11].

Вопрос местного лечения инфицированных ран и ожогов в настоящее время остается предметом дискуссий. Доступные антисептические средства в большинстве случаев не способны воздействовать на весь перечень микроорганизмов, вегетирующих в гнойной ране, в т.ч. ожоговой, период их действия весьма ограничен, а зачастую, они оказывают ингибирующее воздействие на процесс репаративной регенерации. Поиск оптимальной рецептуры антисептического средства, отвечающего всем требованиям гнойной хирургии и комбустиологии, является актуальной задачей медицины. Результаты настоящего клинического исследования демонстрируют, что одной

из них может стать гидрогелевое раневое покрытие на основе природного пептидного комплекса FLIP7.

Материалы и методы

Клиническое исследование гидрогелевого раневого покрытия с природными антимикробными пептидами выполнено с участием 20 пациентов с дермальными ожогами кожи II-IIIа степени (согласно классификации, принятой XXVII съезде хирургов СССР), включение которых осуществлялось в соответствии с критериям включения/исключения после подписания добровольного информированного согласия. Согласно гендерному анализу все испытуемые относились к мужскому полу, возрастом от 19 до 60 лет (средний 42,2 года) и давностью ожога от 4 до 6 суток (в среднем нанесение препарата начинали на 5 сутки, после развития в ней микробного воспаления).

Нанесения исследуемого гидрогелевого покрытия осуществляли на раневую поверхность площадью около 200 см2, ежедневно. Методика аппликации препарата заключалась в предварительной обработке раны нейтральным раствором (физиологическим раствор) с последующим её высушиванием стерильной салфеткой и поверхностной аппликацией тонким слоем гидрогелевого покрытия, содержавшего пептидный комплекс FLIP7.

Длительность наблюдения составила 7 дней, в течение которых оценивались данные общего состояния (температура, АД), результаты лабораторных (общий анализ крови) исследований. Местный статус течения раневого процесса анализировался с использованием разработанной бальной шкале (табл. 1) и планиметрических показателей ежедневно, в течение 7 дней. Динамику репаративной регенерации также оценивали по индексу заживления, расчет которого осуществлялся по формуле:

(S -Sn) x 100 SxT где: S — площадь раны при предыдущем измерении, мм2; Sn — площадь раны при данном измерении, мм2; T — интервал между измерениями, сутки.

Микробиологические исследования предусматривали посев раневого отделяемого на питательные среды с последующим подсчетом числа колиениобразующих единиц (КОЕ). Клеточный состав на поверхности раны оценивался путем цитологического исследования мазков-отпечатков, результаты которого фиксировались с использованием бальной системы. Она основывалась на количестве клеточных элементов в поле зрения: 0 — нет, 1 — единично, 2 — умеренно, 3 — неравномерно, 4 — обильно.

Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием программ Excel и SPSS Statistics 17.0. Для анализа достоверности полученных результатов, в связи с отсутствием группы сравнения, использовался непараметрический критерий для связанных

Табл. 1. Балльная шкала оценки местного статуса

Оценка течения раневого процесса (баллы):
характер отделяемого		количество отделяемого
нет	0	скудное	0
серозное	1	умеренное	1
серозно-гнойное	2	обильное	3
гнойное	3
характер некроза		перифокальное воспаление
нет	0	нет	0
сухой	1	умеренные	2
смешанный	2	выраженное	4
влажный	3
выраженность болевого синдрома		локальный отек
нет	0	нет	0
умеренная	1	умеренный	1
значительная	2	выраженный	3
кровоточивость раны
нет	0
умеренная	1
значительная	2

ИТОГО:

Оценка эпителизации (баллы)
Активность		Характер
Нет	0	Нет	0
Вялая	1	Краевая	1
Умеренная	2	Островковая	2
Активная	3	Смешанная	3

ИТОГО:

выборок T-Вилкоксона. Нулевая гипотеза опровергалась при p<0,05.

Результаты и обсуждение. Ведение ран в условиях влажной среды является одной из основных и наиболее эффективных методик лечения ран, в т.ч. дермальных ожогов. Установлено, что гидрогелевое раневое покрытие обладает способностью оказывать комплексное воздействие на раневой процесс, обеспечивая течение последнего в условиях влажной среды без пересыхания тканей. Углубленная характеристика раневого процесса приведена в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, позволяют заключить, что после начала применения покрытия в течение нескольких суток констатированы явления купирования воспалительного процесса, в т.ч. болевого синдрома, отека и кровоточивости раны, которые полностью исчезали к 5-му дню исследования. Характер отделяемого изменялся от гнойно-серозного до серозного уже после первых суток применения. О положительном влиянии на раневой процесс свидетельствуют бальные критерии оценки. На 0-е сутки наблюдения общий балл по принятой системе в среднем составлял 9 единиц, тогда как уже через три и семь суток применения гидрогелевого покрытия удалось его снизить до 3 и 0 единиц, соответственно.

Согласно научной гипотезе, применение гидрогелевого покрытия на основе комплекса пептидов FLIP7

Табл. 2. Результаты клинической оценки раневого процесса в зависимости от сроков лечения

Анализируемый показатель	Длительность наблюдения
	0 сутки	1 сутки	2 сутки	3 сутки	4 сутки	5 сутки	6 сутки	7 сутки
	Средний балл, Me
характер отделяемого	2	2	1	1	1	1	1	0
кол-во отделяемого	1	1	1	1	1	0	0	0
характер некроза	0	0	0	0	0	0	0	0
перифокальное воспаление	2	1	1	1	0	0	0	0
боль	2	2	1	1	1	0	0	0
отёк	1	1	0	0	0	0	0	0
кровоточивость	1	1	1	1	0	0	0	0
итого	9	8	5	5	3	1	1	0

позволит оптимизировать течение раневого процесса и ускорить процесс репаративной регенерации дермального ожога. Динамика заживления ожоговой раны в анализируемой группе пациентов представлена на рисунке 1.

Данные рисунка 1 позволяют заключить, что на фоне применения гидрогелевого раневого покрытия на основе природного пептидного комплекса FLIP7 площадь раны на протяжении 7 суток имела отчетливую тенденцию к сокращению. По сравнению с исходным размером, на вторые сутки исследования площадь ран сократилась

О сутки 1 сутки 2 сутки 3 сутки 4 сутки 5 сутки 6 сутки 7 сутки

Длительность наблюдения

-^ Средняя площадь раны, (см кв.), Me

-*- Средний индекс заживления (единицы), Me

Примечание: * — различия статистически значимы (при <О,О5) относительно исходного уровня.

Рис. 1. Планиметрическая оценка регенерации ожоговой раны.

на 27,5% (p<0,05), а к 4-м уже на 69,6% (p<0,05). К исходу 7-х суток у 16 из 20 (80%) пациентов ожоговая рана полностью эпителизировалась.

Анализ динамики индекса заживления также свидетельствует о нарастающей интенсивности репаративной регенерации ожоговой раны на фоне применения исследуемого препарата. На 1-е сутки наблюдения анализируемый показатель составлял лишь 10 единиц, однако к исходу исследования его величина увеличивалась до 85,4 единиц, что в 8,5 раз больше (p<0,05) начального значения (Рис. 2).

Рис. 2. Пациент А., 46 лет. Результаты лечения гидрогелевым раневым покрытием на основе комплекса природных пептидов FLIP7. А — внешний вид раны в начале исследования. Б — 4 сутки лечения. В — 7 сутки наблюдения, полная эпителизация ожога.

Инфекционный процесс, развивающийся в организме в условиях нормальной резистентности и реактивности организма, в большинстве случаев сопровождается повышением значений лабораторных показателей — увеличением абсолютного уровня лейкоцитов и нейтрофилов, характеризующих иммунный ответ без явлений декомпенсации и системного воспаления. Их динамика в анализируемой группе больных представлена на рисунке 3.

Анализ результатов, представленных на рисунке 3, позволяет заключить, что использованием природного антимикробного пептидного комплекса FLIP7 позволило достоверно снизить выраженность микробного воспаления, что сопровождалось снижением абсолютного числа лейкоцитов и нейтрофилов. К исходу исследования первый уменьшился на 26,2% (с 10,75х109/л до 7,98х109/л) (p<0,05). Количество нейтрофилов в крови при этом также снизилось на 19,1% (с 72,4% до 58,6%) (p<0,05). Клинически значимых отклонений в лабораторных показателях крови, интерпретируемых как побочное действие или нежелательное явление, в ответ на применение исследуемого препарата отмечено не было.

Данные субъективных (бальная оценка) и объективных (лабораторные показатели, планиметрия) методов исследования подтверждались результатами цитологического исследования мазков-отпечатков с поверхности ожоговой раны. Установлено, что до начала лечения гидрогелевым покрытием при микроскопии мазка-отпечатка с ожоговой раны визуализировалось обильное количество лейкоцитов при полном отсутствии фибробластов. К 4-5 суткам наблюдения отмечено снижение интенсивности воспалительного процесса (уменьшение общего количества лейкоцитов в поле зрения) с интенсификацией регенераторного потенциала, характеризующегося умеренным увеличением фибробластов. В связи с полной эпителизацией ожоговой раны у большинства пациентов до окончания исследования оценка анализируемых показателей на 7 сутки не выполнялась.

Активность FLIP7 в отношение бактерий обеспечивают 4 семейства антимикробных пептидов — дефензины, цекропины, диптерицины и пролинбогатые пептиды. Исследование антибактериального эффекта осуществлялось путем подсчета количества видов микроорганизмов в ожоговой ране и измерением их концентрации. Установлено, что в ожоговых ранах на 0 сутки наблюдения было верифицировано в среднем по 2 вида микроорганизмов, преимущественно Staphylococcus aureus, коагулазонегативный стафилококк и Enterococcus spp. в концентрации, в среднем, 2х10 3 КОЕ. Применение гидрогелевого покрытия на основании FLIP7 позволило к 4-м суткам сократить анализируемые показатели практически в 2 раза (p<0,05), а к исходу недели полностью элиминировать патогенную микрофлору (табл. 3).

В соответствии с данными, представленными в таблице 3, у 95% пострадавших с дермальными ожогами, включенных в исследование, констатировано наличие

I I 0 сутки I I 4 сутки I I 7 сутки

Примечание: * — различия статистически значимы (при <0,05) относительно исходного уровня.

Рис. 3. Динамика уровня лейкоцитов и нейтрофилов на фоне применения FLIP7.

Табл. 3. Микробная обсемененность ран на фоне применение природного комплекса пептидов FLIP7

	Сутки с начала лечения
	0	4	7
Количество пациентов с развитием микробного воспаления	19 = 95%	12 = 60%	2*= 10%
Staphylococcus aureus	12	3	2*
Coagulase negative staphylococcus	7	3	0
Enterococcus spp.	3	2	0
Klebsiella pneumoniae	1	2	0
Corynebacterium spp	1	2	0
Streptococcus pyogenes	0	1	0

Примечание : * — два пациента с вторичной инфекцией S. aureus на 7-е сутки с начала лечения (в период с 0 по 4-е сутки инфекция отсутствовала).

патогенной микрофлоры с области ран с преобладанием стафилококковой инфекции. Аппликация раневого покрытия на основе FLIP7 позволила к 4-м суткам наблюдения снизить число пациентов с контаминированной ожоговой раной до 60% (12 пострадавших), а к завершению исследования полностью элиминировать патогенные штаммы у 90% испытуемых. К 7-м суткам у 2 из 20 (10%) пострадавших в посевах с поверхности ран был верифицирован полирезистентный Staphylococcus aureus, который у них отсутствовал на 0 и 4 сутки исследования. Оба факта были расценены, как следствие вторичного инфицирования, и не учитывались в заключительных результатах.

Выводы

Гидрогелевое раневое покрытие на основе комплекса природных антимикробных пептидов FLIP7 является эффективным средством для местного лечения дермальных ожогов, которое позволяет не только стимулировать репаративную регенерацию в ране, но и эффективно элиминировать патогенную микрофлору. Рецептура медицинского изделия способствует оптимизации тече-

ния раневого процесса, которая отражается в изменении таких показателей как отек, перифокальное воспаление, характер отделяемого, кровоточивость и т.д. Гель легко наносится на раневую поверхность и предотвращает адгезию перевязочного материала. После смены повязок и повторном нанесении покрытия испытуемые отмечали субъективное снижение интенсивности болевого синдрома в области ожога, а сам процесс перевязки не доставлял дискомфорта. При этом необходимо отметить, что в ходе исследования. Ни одного случая или эпизода побочного действия и нежелательного явления аллерги-ческой/неаллергической этиологии в ходе исследования не выявлено.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов (The authors declare no conflict of interest).