Клинические аспекты хемилюминесценции клеток крови телят при бронхопневмонии

Введение. Одной из наиболее актуальных проблем ветеринарной медицины является бронхопневмония телят, что обусловлено ее значительным распространением среди других патологий молодняка крупного рогатого скота и риском развития тяжелых осложнений [5]. По данным ряда авторов, болезни органов дыхания у телят регистрируются до 20–30 % от общей заболеваемости молодняка крупного рогатого скота [9]. В настоящее время высокий уровень заболеваемости бронхопневмонией сохраняется среди всех возрастных групп телят, придавая проблеме диагностики, терапии и профилактики особую значимость и актуальность [1].

Патогенез бронхопневмонии отличается сложностью и многообразием, а тяжесть течения и исход заболевания во многом зависят от состояния иммунной системы и неспецифической резистентности животного. Первую линию защиты организма составляют лейкоциты крови, особенно нейтрофильные гранулоциты, обладающие высокой реактивностью, способностью отвечать на дестабилизацию внутренней среды и регулировать развитие воспаления [8].

Изменение метаболических процессов в нейтрофилах при воспалительных реакциях сопровождается развитием «респираторного взрыва» с последующей продукцией активных форм кислорода (АФК), обладающих выраженным цитотоксическим эффектом [7]. Степень развития кислородного взрыва при различных заболеваниях и уровень продукции АФК фагоцитами крови определяется методом хемилюминесцентного анализа [4], который может служить объективным критерием оценки тяжести воспалительного процесса.

Цель исследования : изучить клинические аспекты применения хемилюминесцентного анализа клеток крови телят, больных неспецифической бронхопневмонией.

Материал и методы исследования. Исследование проведено на кафедре анатомии, патологической анатомии и хирургии Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ и на базе Международного научного центра исследований экстремальных состояний организма Красноярского научного центра СО РАН. Объектом исследования являлись клинически здоровые и больные бронхопневмонией телята 1,5–2месячного возраста, голштинизированной породы, черно-пестрой масти, содержащиеся в условиях АО АПХ «АгроЯрск» Сухобузимского района Красноярского края.

При клиническом исследовании молодняка крупного рогатого скота (17 гол.) определены следующие параметры: состояние видимых слизистых оболочек, температура тела, пульс, частота дыхательных движений, результаты аускультации легких. Температуру тела определяли ректально, пульс – по хвостовой артерии. По результатам обследования всех животных разделили на две группы – здоровые (5 гол.) и больные бронхопневмонией (12 гол.).

Материалом для хемилюминесцентного анализа служила цельная венозная гепаринизированная кровь. Течение свободнорадикальных процессов в клетках крови изучено в хемилюминесцентной реакции по методу Tono-Oke в модификации А.М. Земскова с соавт. (1994) и И.Ю. Ерёминой с соавт. (2010) с использованием 36-канального аппаратурно-программного комплекса «Хемилюминометр CL-3604», совмещенного с ПЭВМ. Исследована хемилюминесценция (ХЛ) клеток нефракционированной крови в состоянии покоя (спонтанная) и при стимуляции клеток in vitro частицами латекса (активированная). В качестве хемилюминесцентных зондов, усиливающих хемилюминесценцию клеток, использованы люцигенин, обладающий селективностью в отношении первичных радикалов (супероксиданион) и люминол, реагирующий с большинством кислородных радикалов, особенно вторичных (гипохлорид, гидроксил, пероксидный радикал, перекись водорода).

Из каждого образца крови готовили четыре пробирки с реакционной смесью, в состав которой входила гепаринизированная кровь в объеме 100 мкл, разведенная раствором Хенкса без фенолового красного в соотношении 1:1; 200 мкл раствора люцигенина (Sigma-Aldrich, Switzerlend). 10-4 М на растворе Хенкса или люминола (Sigma, USA) в концентрации 2,2∙10-4 М при рН=7,4; 50 мкл взвеси частиц латекса в концентрации 5∙108 частиц/мл, опсонизированных белками пуловой сыворотки крови крупного рогатого скота. Время записи хемилюминесцентной кривой составляло 180 мин при температуре в регистрационной камере +38 оС, практически соответствующей температуре тела клинически здоровых животных.

Об уровне продукции активных форм кислорода (АФК) судили по суммарной продукции свободных кислородных радикалов, генерируемых клетками крови в течение всей ХЛ-реакции (S, импульсов за 180 мин). Определение количества лейкоцитов и активных фагоцитов в периферической крови телят выполняли с помощью камеры Горяева при окрашивании образцов крови 0,25 %-м генцианвиолетом в 3 %-й уксусной кислоте. Фагоцитарный индекс определяли, как отношение лейкоцитов с частицами латекса в цитоплазме к общему содержанию лейкоцитов, выраженное в процентах [6]. Учитывая суммарную продукцию АФК, степень разведения крови в составе реакционной смеси, общее содержание лейкоцитов и фагоцитарный индекс, рассчитывали удельную антигенинду-цированную продукцию радикалов на один лейкоцит и фагоцит (S/лейкоцит и S/фагоцит, имп./клетку).

Степень достоверности различий сравниваемых показателей оценивали методом вариационной статистики, используя t-критерий Стьюдента. Статистически достоверными считали различия при Р ≤ 0,05.

Результаты исследования. При клиническом обследовании больных бронхопневмонией телят установлена одышка, повышение температуры от 39,2 до 41,5 оС, дыхание поверхностное, переходящее в брюшное, частота дыхательных движений до 35–40 в минуту, пульс учащен до 115–130 ударов в минуту, при аускультации – дыхание жесткое и везикулярное. Кроме того, наблюдались серозные, а у отдельных телят слизисто-гнойные истечения из носа и сухой отрывистый кашель. Больные телята вялые, с пониженным аппетитом, шерсть тусклая и взъерошенная.

На рисунке 1 представлено общее содержание лейкоцитов в крови здоровых и больных телят и их фагоцитарная активность в отношении частиц латекса. Количество лейкоцитов у больных животных более чем в два раза превысило показатели здорового молодняка и составило 24,26±2,75∙109/л (Р ≤ 0,01). Заболевание стимулировало фагоцитарную активность лейкоцитов, о чем свидетельствовал рост фагоцитарного индекса в 2,6 раза – с 21,78±2,26 до 53,99±5,18 % (Р ≤ 0,001).

30,00

25,00

20,00

15,00

10,00

5,00

0,00

больные здоровые

Рис. 1. Общее содержание лейкоцитов (А) и их фагоцитарный индекс (Б) в отношении частиц латекса у здоровых телят и больных бронхопневмонией; * Р ≤ 0,01, ** Р ≤ 0,001 относительно здоровых животных

60,0

50,0

40,0

30,0

20,0

10,0

0,0

здоровые больные

Хемилюминесцентный анализ клеток крови показал, что у больных телят суммарные объемы активированных и спонтанных люминолза-висимых АФК, продуцированные на протяжении ХЛ-реакции, почти в два раза превысили показатели здоровых животных (табл. 1). Очевидно, что увеличение генерации вторичных люминол-зависимых радикалов, таких как гидропероксид, гидроксил радикал, гипохлорит и другие, неизбежно ведет к усилению процессов перекисного окисления липидов и повреждению клеточных мембран, что играет существенную роль в патогенезе бронхопневмонии.

Генерация активированных латексом клеток первичных люцигенинзависимых радикалов у больных телят превысила показатели здоровых животных всего на 17 %, в то время как объемы АФК, образованные при спонтанной продукции, были почти в четыре раза больше, чем у здоровых телят. При этом отмечены значительные колебания индивидуальных показателей хемилюминесценции клеток крови, что указывало, на наш взгляд, на разную степень тяжести течения болезни.

Анализ результатов хемилюминесцентного анализа и клинического обследования позволил выявить особенности генерации клетками крови свободных радикалов в зависимости от степени тяжести бронхопневмонии (см. табл. 1). Объемы первичных люцигенинзависимых АФК при спонтанной генерации увеличились при легкой степени болезни почти на 66 %, а при средней – более чем в 10 раз. При этом тяжесть течения бронхопневмонии практически не влияла на продукцию люцигенинзависимых радикалов клетками, антигенактивированными in vitro частицами латекса.

Тяжесть течения бронхопневмонии значительно влияла на продукцию вторичных люми-нолзависимых АФК. Объемы спонтанных люми-нолзависимых радикалов при легкой и средней степени болезни увеличились на 74 % (Р ≤ 0,05) и в 2,65 раза (Р ≤ 0,01) соответственно. Активированная латексом продукция люминолзависи-мых АФК при легкой тяжести заболевания выросла на 21 %, а при средней – более чем в 4 раза (Р ≤ 0,01).

Рис. 2. Суммарная продукция АФК клетками крови здоровых и больных бронхопневмонией телят при люминол- и люцигенинзависимой ХЛ-реакции, млн имп. за 180 мин;

* Р ≤ 0,05 относительно здоровых животных

Низкие значения суммарных объемов продукции всех видов свободных кислородных радикалов при тяжелой степени болезни указывали, по нашему мнению, на истощение функциональных возможностей лейкоцитов крови как факторов неспецифической защиты организма.

При этом у телят с тяжелой степенью течения бронхопневмонии наблюдались повышение температура тела до 41,0–41,5 °С, одышка, брюшной тип дыхания, слизисто-гнойные истечения из носовых отверстий, сухой отрывистый кашель, вялость, сниженный аппетит.

Таблица 1

Суммарная продукция (S, млн имп. за 180 мин) люминол- и люцигенинзависимых АФК клетками крови больных телят при разной степени тяжести бронхопневмонии

Степень тяжести болезни	n, гол.	Люминолзависимая ХЛ		Люцигенинзависимая ХЛ
		активир.	спонтан.	активир.	спонтан.
Контроль	5	4,50±0,62	0,68±0,11	1,92±0,36	0,32±0,06
Легкая	5	5,46±0,52	1,18±0,18*	2,12±0,05	0,53±0,08
Средняя	4	18,20±2,25**	1,80±0,23**	3,02±1,59	3,51±2,19
Тяжелая	3	2,84±0,31*	0,67±0,14	1,29±0,17	0,25±0,07

Примечание : * Р ≤ 0,05; ** Р ≤ 0,01 относительно контрольных здоровых телят.

Значение индекса активации, определяемое как соотношение между суммарными объемами хемилюминесценции при активированной и спонтанной продукции АФК, отражает потенциальные возможности лейкоцитов крови к индукции «респираторного взрыва» при дополнительных антигенных нагрузках. Усиление свободнорадикальных процессов в нестимулиро-ванных клетках крови, находящихся в состоянии «покоя», привело к снижению индекса активации у больных телят по сравнению со здоровыми животными, при генерации люминолзависи-мых радикалов на 9,3 % – с 6,88±0,99 до 6,24±0,23 усл. ед., а люцигенинзависимых на 27 % – с 5,28±0,51 до 3,86±0,70 усл. ед.

У больных животных отмечены достоверные отличия от здоровых в показателях удельной антигенактивированной продукции радикалов на один лейкоцит и фагоцит (табл. 2). Удельная продукция люминолзависимых вторичных радикалов на один лейкоцит при активированной латексом ХЛ-реакции на 61 % превысила показатели здоровых животных (Р ≤ 0,05), в то время как показатели первичных люцигенинзави-симых АФК упали более, чем на 35 % (Р ≤ 0,05). Удельный объем продукции свободных люминол- и люцигенинзависимых радикалов на один фагоцит при индуцированном латексом респираторном взрыве сократился на 70 % (Р ≤ 0,01) и в 4,5 раза (Р ≤ 0,001) соответственно.

Таблица 2

Удельная продукция люминол- и люцигенинзависимых АФК лейкоцитом (S, имп./кл. за 180 мин) при антигенной активации in vitro в крови здоровых телят и больных бронхопневмонией

Состояние телят	S/лейкоцит		S/фагоцит
	люминол	люцигенин	люминол	люцигенин
Здоровые	2,92±0,18	14,34±0,77	3,10±0,21	14,40±0,71
Больные	4,69±0,71*	9,27±1,72*	1,82±0,23**	3,21±0,49***

Примечание : * Р ≤ 0,05; ** Р ≤ 0,01; *** Р ≤ 0,001 относительно здоровых животных.

Выводы. При бронхопневмонии телят наблюдается повышение общего содержания лейкоцитов крови, что сопровождается усилением их фагоцитарной активности и повышением продукции свободных кислородных радикалов.

Значения параметров хемилюминесцентной кинетики генерации АФК клетками крови зависят от степени тяжести течения болезни. При тяжелом течении заболевания отмечается быстрое метаболическое истощение радикалобразую-щей активности клеток неспецифической резистентности, участвующих в защитных реакциях организма.

Хемилюминесцентная оценка кинетики респираторного взрыва при активации in vitro фагоцитирующих клеток крови и без нее позволяет охарактеризовать фундаментальные механизмы реагирования клеток неспецифической врожденной защиты организма при воспалительных процессах.