Клиническое значение полиморфизма генов липидтранспортной системы у больных нестабильной стенокардией с отягощенным семейным анамнезом

Известно, что в развитии ишемической болезни сердца (ИБС), наряду с фенотипическими факторами внешней среды важную роль играет генетическая предрасположенность к заболеванию. Так как проведение одновременного анализа всех генов-кандидатов представляется на сегодняшний день сложной задачей, необходимо выделение группы генов с потенциально наибольшим вкладом в патогенез заболевания. Полиморфизм генов, регулирующих транспорт и метаболизм липидов – аполипопротеинов А, В и Е играет важную роль в липидном метаболизме и непосредственно может влиять на развитие атеросклероза. Белки аполипопротеинов А, В и Е участвуют в создании, секреции, транспорте и связывании макромолекулярных липопротеидных комплексов [1,2,3].

Цель исследования: изучить распределение полиморфизма генов аполипопротеинов А1, В и Е липидтранспортной системы у больных нестабильной стенокардией (НС) узбекской национальности с семейным анамнезом ИБС и их возможное влияние на клиническое течение и исходы заболевания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обследовано 125 больных узбекской национальности с НС напряжения II B класс (E. Braunwald et al., 1989), с гиперхолестеринемией – холестерин липопротеидов низкой плотности (ХС ЛПНП) >100 мг/дл. Группу сравнения составили 58 здоровых лиц узбекской национальности без клинических и инструментально-диагностических признаков ИБС (по данным теста с физической нагрузкой), сопоставимых с больными основной группы по полу, возрасту и не имеющих отягощенного семейного анамнеза ИБС.

Из исследования исключали пациентов с инфарктом миокарда (ИМ), перенесенным в предшествующие 3 месяца, больных с СД 2-го типа, требующих лечения инсулином, с артериальной гипертензией II-III степени (АД > 159/99 мм рт. ст.), гипотонией (АД < 100/60 мм рт. ст.), мерцательной аритмией и жизнеопасными желудочковыми нарушениями ритма сердца, хроническими обструктивными заболеваниями лёгких, с хронической сердечной недостаточностью выше I ФК (NYHA), хронической почечной и печёночной недостаточностью.

Для объективной оценки уровня биомаркеров воспаления критериями исключения также являлись: наличие у пациентов острых или обо- стрения хронических инфекционных, воспалительных и аутоиммунных заболеваний в течение менее 1 месяца после наступления полной клинической и лабораторной ремиссии.

Семейный анамнез: оценка семейного анамнеза проводилась на основе опроса больного с помощью стандартного опросника ВОЗ «Семейный анамнез». Регистрировали наличие у родственников 1 степени родства (родители, родные братья и сестры, дети) наличие смерти от инфаркта миокарда или инсульта, перенесенные НМК или инфаркты миокарда, наличие артериальной гипертонии. Семейный анамнез считали отягощенным при наличии у больного 2–х или более «пораженных» родственников. В исходном периоде проводилась верификация диагноза НС, соответствующая рекомендациям ЕОК (недавняя дестабилизация стабильно протекающей стенокардии, достигающей как минимум III ФК Канадской классификации) [4].

Ультразвуковое исследование сонных артерий – определяли толщину комплекса интима-медиа (КИМ) общей сонной артерии (ОСА) путем сканирования в В-режиме цветным допплеровским картированием потока на ультразвуковой системе «ALOKA – Multi View» (Япония) линейным датчиком с частотой 7 МГц [20м]. Ультразвуковое исследование сердца проводили на эхокардиографе «ALOKA – Multi-View» по стандартной методике согласно рекомендациям Американской ассоциации эхокардиографии. Определяли конечно-диастолический, конечно-систолический размеры ЛЖ, с оценкой параметров систолической и диастолической функции ЛЖ. Все измерения проводили не менее чем в 5 сердечных циклах, затем результаты усредняли. Суточное мониторирование ЭКГ выполнялось по стандартной методике на аппарате Cardiolab, (ХАИ, Украина).

Определение липидов крови. Забор крови осуществляли на следующий день после поступления пациентов в стационар в утренние часы, после 12 часового голодания, из локтевой вены, в горизонтальном положении больного. Определение липидов крови – общего холестерина (ХС), ХС липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), триглицеридов (ТГ) – выполняли ферментативным методом на биохимическом анализаторе «Daytona» (RANDOX, Великобритания). Концентрация ХС ЛПНП определялась по формуле Фрид-вальда: ХС ЛПНП= ХС – ХС ЛПВП – ТГ/5 (мг/дл); коэффициент атерогенности (КА) определяли по формуле: КА = (ХС – ХС ЛПВП) / ХС ЛПВП (от.ед). Концентрация вч-С-реактивного (С-РБ) белка определялась высокочувствительным методом иммунотурбидиметрии с латексным усилением на аппарате «Daytоna» (RANDOX, Великобритания). Нижняя граница определения составляла 0,20 мг/л. Кровь для исследования С-РБ была взята натощак.

Содержание аполипопротеинов А-1, В определяли на биохимическом автоанализаторе «Daytоna» (RANDOX, Великобритания), с помощью метода иммунотурбидиметрии с использованием моноспецифических антител к человеческому апо-В. Рассчитывали соотношение апо-В/апо-А. Значение коэффициента считали нормальным при величине соотношения <1,0. Определение концентрации Лп (а) (мг/дл) в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуноферментно-го анализа с использованием моноспецифических антител к Лп (а) человека. Уровень липопротеина (а) принимали за повышенный свыше 30 мг/дл.

Конечными точками при годичном наблюдении в исследовании были: повторная госпитализация вследствие дестабилизации стенокардии, выполненные хирургические вмешательства (АКШ и ЧКВ со стентированием), фатальный и нефатальный ИМ, инсульт и смерть от сердечно-сосудистых причин.

Произведено генотипирование 183 образцов цельной крови по заказу лаборатории ИБС РСЦК МЗ РУз. Для исследования было выбрано 3 гена-кандидата, полиморфные варианты которых согласно международным базам данных ассоциируются с ИБС.

Выделение геномной ДНК. Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови по стандартному протоколу с использованием набора реагентов Diatom TM DNA Prep 200 (производство ООО «Лаборатория ИзоГен»). Проведение полимеразноцепной реакции (ПЦР): генотипирование генов РААС методом ПЦР проводили в лаборатории функциональной геномики человека Института генетики и экспериментальной биологии растений АН РУз с использованием термоциклера PCR Systems 2700 («Applied Biosystems», США) и в лаборатории АГ и МГИ РСЦК на термоциклере GeneAmp PCR Systems 9700 («Applied Biosystems», США).

Для генотипирования полиморфных маркеров генов использовались следующие пары праймеров:

• •    G-A полиморфизм гена АпоА 1:

5’-AGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAG-3’ (прямой праймер)

5’-TTAGGGGACACCTAGCCCTCAGGAAGAGCA-3’ (обратный праймер)

• •    -516C/T полиморфизм гена АпоВ использовалась следующая последовательность праймеров (Sposito, 2004):

5’-GCT GGG GTT TCT TGA AGA CA-3’ (прямой праймер)

5’-CAA GCG TCT TCA GTG CTC TG-3’ (обратный праймер)

• •    ε2/ε3/ε4 полиморфизм гена AпоЕ:

Upstream primer =

5’TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA3’

Downstream primer=5’ACAGAATTCGCCCCGGCCTG GTACACTGCCA3’

Статистическая обработка результатов исследований:

При проведении статистического анализа полученных данных использованы возможности электронных таблиц Microsoft Excel и пакета статистического анализа Statistica 6.0. Полученные результаты представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения (М±SD), статистическая значимость полученных измере-

Табл. 1. Клинико-демографическая характеристика обследованных (М±SD, n %)

Показатели	Больные НС (n=125)	Здоровые (n=58)
Возраст	54,8±9,5	53,6±11,3
Пол (муж/жен), n (%)	71/54 (56,8%/43,2%)	30/28 (51,7%/48,3%)
Отягощенный семейный анамнез, n(%)	63 (50,4%)	0
Сахарный диабет, n(%)	26 (20,8 %)	0
ЧСС, уд/мин	78,2±12,6***	68,6±5,9
САД, мм Hg	136,0±21,4***	120,7±8,1
ДАД мм Hg	86,5±11,7***	77,2±5,2

Примечание: *** - Р<0,001 – достоверность различий относительно группы здоровых лиц.

ний при сравнении средних величин определялась по критерию Стьюдента (t) с вычислением вероятности ошибки (Р) при проверке нормальности распределения. Если распределение изучаемых переменных отличалось от нормального, применяли непараметрические критерии анализа: критерий Т Манна-Уитни для двух выборок. Для нахождения различий между качественными показателями использовали метод χ2. За статистически значимые изменения принимали уровень достоверности Р<0,05 (95%-й уровень значимости). Для сравнения частот благоприятного и неблагоприятного исхода в несвязанных группах вычисляли отношение шансов (odds ratio – OR) c определением доверительного интервала (ДИ). Различия по изучаемому бинарному признаку считали статистически значимыми, если ДИ для OR не включал в себя единицу. Под выживаемостью понимали вероятность отсутствия неблагоприятного исхода в течение 12 месяцев после НС.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Среди обследованных 183 лиц узбекской национальности в основную группу вошли 125 больных с нестабильной (прогрессирующей) стенокардией II B класс (Braunwald E. et al., 1989), в группу контроля – 58 здоровых лиц (табл. 1). В группе нестабильной стенокардии 63 (50,4%) больных имели отягощенный семейный анамнез (табл. 1).

125 больных с НС были разделены на две группы: I группа (n=63) имела отягощенный семейный анамнез ИБС и II группа (n=62) без отягощенного семейного анамнеза. При сравнительном анализе обе группы больных не отличались по исходным клинико-гемодинамическим показателям (табл. 2,3), однако, в I группе отмечались более высокие значения КИМ сонных артерий.

Также изучаемые группы не отличались по исходным значениям биохимических показателей, хотя уровень вч-С-РБ был несколько выше в I группе (Р<0,05) (табл. 3).

Табл. 2. Сравнительная оценка исходных клинико-гемодинамических и биохимических показателей в исследуемых группах больных нестабильной стенокардией в зависимости от семейного анамнеза (М±SD, n(%))

Показатели	Больные с отягощенным семейным анамнезом, (I группа)	Больные без семейного анамнеза, (II группа)
n	63 (50,4%)	62 (49,6%)
Возраст	53,1±10,3	56,4±8,4
Пол (муж/жен)	36/27 (57,1%/42,9%)	35/27 (56,5%/43,5%)
Длительность ИБС, лет	5,6±4,2	5,5±4,5
Гипертоническая болезнь	60 (95,2%)	55 (88,7%)
Инфаркт миокарда в анамнезе	26 (41,3%)	24 (38,7%)
Сахарный диабет	14 (22,2%)	12 (19,4%)
В анамнезе ОНМК	5 (7,9%)	2 (3,2%)
Частота приступов стенокардии, за 1 нед.	29,1±9,1	28,2±7,5
Количество потребляемого нитроглицерина, за 1 нед.	20,3±8,0	20,1±5,2
Частота сердечных сокращений, уд./мин.	78,1±12,8	78,2±12,4
Систолическое АД, мм Hg	136,5±19,5	135,9±23,4
Диастолическое АД мм Hg	86,4±11,3	86,6±12,2
КДО ЛЖ, мл	140,5±30,9	149,4±30,5
КСО ЛЖ, мл	53,4±23,8	58,5±21,8
ФВ ЛЖ, %	62,7±9,2	61,8±8,3
КИМ прав.	1,02±0,22	0,96±0,20
КИМ лев.	1,02±0,23*	0,93±0,22

Примечание: * - Р<0,05 – достоверность различий относительно группы больных без отягощенного семейного анамнеза.

Табл. 3. Сравнительная оценка исходных показателей липидного обмена, биомаркеров липидного обмена и воспаления в исследуемых группах больных нестабильной стенокардией в зависимости от семейного анамнеза (М±SD)

Показатели	Больные с отягощенным семейным анамнезом, n=63	Больные без семейного анамнеза, n=62
Общий ХС, мг/дл	218,2±49,1	217,4±38,0
ТГ, мг/дл	193,7±79,8	196,5±95,3
ХС ЛПНП, мг/дл	141,0±41,3	139,5±36,2
ХС ЛПВП, мг/дл	38,1±9,0	38,9±8,7
ХС ЛПОНП, мг/дл	39,6±16,8	42,2±22,0
КА, отн.ед.	4,9±1,6	4,7±1,3
Апо А, мг/дл	131,1±41,0	126,2±26,1
Апо В, мг/дл	102,0±28,4	99,5±27,8
АпоВ/АпоА, ед	0,8±0,3	0,8±0,3
ЛП (а), мг/дл	35,6±18,7	39,1±14,2
вчC-РБ, г/л	12,0±10,8 *	8,2±8,4

Примечание: * - Р<0,05 – достоверность различий относительно группы больных без отягощенного семейного анамнеза.

При изучении распределения повреждающих аллелей изучаемых генов в целом среди больных НС в сравнении со здоровыми лицами была выявлена большая распространённость носительства аллели А гена АпоА1, а также тенденция к более частой встречаемости аллели ε4 гена АпоЕ среди больных (табл. 4). При раздельном сравнении изучаемых групп оказалось, что во II группе распределение «повреждающих» аллелей достовер- но не различалось с группой здоровых лиц, тогда как в I группе отмечалось достоверно большее накопление аллелей: «А» G-A полиморфизма гена АпоА1, «ε4» гена AпоЕ. При этом не было выявлено различий в частоте носительства «Т» аллели -516C/T полиморфизма гена АпоВ.

За весь период наблюдения конечных точек достигли 60 (48,0 %) из 125 обследованных больных с нестабильной стенокардией, благоприят-

Табл. 4. Распределение полиморфизма генов аполипопротеинов А1, В и Е регулирующих липидный обмен – и I/D полиморфизма гена АПФ у больных нестабильной стенокардией узбекской национальности в зависимости от семейного анамнеза

Гены	«Повреждающие» аллели	Больные НС (n=125)	Семейный анамнез, (n=63)	Без семейного анамнеза, (n=62)	Здоровые (n=58)
AпоA1	A-носители против GG	50/75 OР 3,63 95% ДИ 1,63-8,04 P=0,002	33/30 OР 5,99 95% ДИ 2,52-14,24 P=0,001	17/45 OР 2,06 95% ДИ 0,83-5,08 НД	9/49
Aпо B	T-носители против CC	50/75 ОР 0,88 95% ДИ 0,46-1,65 НД	25/38 OР 0,87 95% ДИ 0,42-1,79 НД	25/37 OР 0,89 95% ДИ 0,43-1,84 НД	25/33
Aпо E	ε4-носители против не-ε4	28/97 OР 2,10 95% ДИ 0,86-5,2 НД	18/45 OР 2,91 95% ДИ 1,12-7,62 P=0,044	10/52 OР 1,40 95% ДИ 0,50-3,97 НД	7/51

Табл. 5. Сравнение влияния «повреждающих» аллелей генов липидтранспортной системы на конечные точки у больных нестабильной стенокардией

Ген Неблагопр/благопр ОШ 95% ДИ χ² p Apo E е4-носители 18/10 Не-е4 42/55 2,36 0,986-5,633 3,04 0,081 Apo B Т-носители 25/25 Не-Т 35/40 1,42 0,691-2,916 0,033 0,855 Apo A А-носители 29/21 Не-А 31/44 1,96 0,949-4,050 2,704 0,10 ный исход заболевания наблюдался у 65 (52,0 %) пациентов. На фоне проводимой гиполипидеми-ческой терапии в течение 1 года не было выявлено достоверных различий в частоте конечных точек у больных стенокардией в зависимости от носительства «повреждающих» аллелей генов липидтранспортной системы: Апо Е, Апо В, Апо А по отдельности. Однако при этом отмечалась тенденция к более высокой частоте событий у носителей е4-аллели гена Апо Е (p=0,081) и А-аллели (p=0,10) гена Апо А (табл. 5).

При сравнении конечных точек была выявлена тенденция к более высокой частоте хирургических реваскуляризаций в группе носителей е4-аллели гена Апо Е (p=0,12) и среди больных носителей А-аллели гена Апо А. Учитывая, что распространённость А-аллели гена Апо А была достоверно выше среди больных ИБС по сравнению со здоровыми лицами, а е4-аллель гена Апо Е преобладала среди больных с семейным анамнезом заболевания, в одну группу выделили пациентов с носительством повреждающих аллелей е4 гена Апо Е и А гена Апо А для сравнения с группой больных, не имеющих «повреждающей» аллели (табл. 6). Как видно из табл. 6, носителей повреждающих аллелей оказалось меньше (67), чем 28+50 (е4+А), за счёт того, что в число лиц носителей 2 аллелей попали 11 больных с носительством е4+А. Ещё 2 больных имели 2 повреждающие аллели ввиду генотипа А+А. Обе группы существенно не отличались по количеству повторных дестабилизаций, однако, при этом частота хирургических реваскуляризаций в группе больных, носителей «повреждающей» аллели наблюдалась у 19 из 67 обследованных (28,4%), тогда как у больных без носительства лишь в 6 случаях из 58 (10,4%), p=0,02. Общее количество сердечно-сосудистых событий также оказалось несколько выше в группе носителей «повреждающей» аллели 56,7% против 37,9% у не носителей,

Табл. 6. Сравнение влияния носительства 1 и более «повреждающих» аллелей генов липидтранспортной системы на конечные точки у больных нестабильной стенокардией

Исходы Неблагопр/благопр 1-2 аллели: Е4,      0: А, Е4+А, А+А    GG, CC (n=67)        (n=58) ОШ 95% ДИ χ² p Повторная дестабилизация 17/50 (25,4%) 15/43 (25,9%) 0,98 0,44-2,90 0,02 0,89 ЧКВ со стентированием 13/54 (19,4%) 3/55 (5,2%) 4,41 1,19-16,4 4,44 0,04 АКШ 6/61 (9,0%) 3/55 (5,2%) 1,80 0,43-7,56 0,22 0,64 Всего: хирургические реваскуляризации 19/48 (28,4%) 6/52 (10,4%) 3,43 1,26-9,31 5,23 0,02 Нефатальный ОИМ 2/65 (3,0%) 1/57 (1,7%) 1,75 0,16-19,9 0,02 0,90 Всего: конечные точки 38/29 (56,7%) 22/36 (37,9%) 2,14 1,05-4,40 3,68 0,06 однако, различие носило недостоверный характер (p=0,06).

Как уже отмечалось выше, среди обследованных оказалось 13 больных с носительством 2 «повреждающих» аллелей: 11 больных с носительством е4+А и 2 больных с генотипом А+А (табл. 7). При сравнении частоты конечных точек у носителей 2 «повреждающих» аллелей по сравнению с другими обследованными оказалась выше частота повторных госпитализаций 38,5% против 24,1%, реваскуляризаций – 38,5% и 17,9%, общее количество конечных точек – 76,9% и 44,6%, однако, во всех случаях различия носили недостоверный характер.

ОБСУЖДЕНИЕ

Особенностью настоящего исследования являлось сравнение распределения аллелей изучаемых генов у больных в зависимости от семейного анамнеза ИБС. Это позволило сравнить распространённость генетических маркеров среди лиц, у которых, возможно, преобладающим являлось влияние «фенотипических» факторов внешней среды с группой больных, у которых решающий вклад могли вносить генетические факторы. Для нас оказалось несколько неожиданным преобладание аллели «А» гена АпоА1 у больных нестабильной стенокардией узбекской национальности в сравнении со здоровыми лицами. В некоторых сообщениях накопление «А» аллели сопровождалось повышением уровня ХС ЛПВП и АпоА1 с ожи- данием снижения риска ИБС [4,5], однако, в других это не подтвердилось [6,7], и даже указывалось на обратную связь [8]. У женщин-носителей А аллеля была обнаружена взаимосвязь между генотипом и диетой, зависящая от АпоА1 G-A полиморфизма: повышенное потребление полиненасыщенных жирных кислот ассоциировалось с повышением концентрации ЛПВП у женщин с А-аллелью, тогда как у женщин с G/G генотипом наблюдался противоположный эффект. В некоторых исследованиях было обнаружено, что носительство А-аллели (М1) в промоутерном регионе гена АпоА1 ассоциируется с достоверным повышением концентрации липопротеина (а) независимо от пола и наличия сахарного диабета [9,10]. Также в некоторых экспериментальных исследованиях было показано, что А аллель связана со снижением транскрипции липопротеина-А1, который, как известно, имеет антиатерогенное значение. В исследовании Requero J.R. et al. указывается на значительное повышение частоты встречаемости А-аллели (М1-) в промоутерном регионе гена АпоА1 у пациентов с нестабильной стенокардией (P<0,05) и, особенно, острым инфарктом миокарда (P=0,009), вне связи с другими факторами риска [11]. Результаты нашего исследования среди лиц узбекской национальности, больных нестабильной стенокардией, подтверждают эти сообщения и позволяют предположить, что неоднородность литературных данных, возможно, связана с различным представительством пациентов с семейным анамнезом ИБС в приведённых исследованиях.

Табл. 7. Сравнение влияния носительства 2 «повреждающих» аллелей генов липидтранспортной системы на конечные точки у больных нестабильной стенокардией

Исходы	Неблагопр/благопр 2 аллели: Е4+А,      0-1: А+А       GG, CC, е4, А (n=13)         (n=112)		ОШ	95% ДИ	χ²	p
Повторная дестабилизация	5/8 38,5%	27/85 24,1%	1,97	0,59-6,52	0,62	0,43
ЧКВ со стентированием	2/11 15,4%	14/98 12,5%	1,27	0,26-6,35	0,02	0,89
АКШ	3/10 23,1%	6/106 5,4%	5,3	1,15-24,5	3,14	0,08
Всего: хирургические реваскуляризации	5/8 38,5%	20/92 17,9%	2,88	0,85-9,71	1,94	0,16
Нефатальный ОИМ	0/13 -	3/109 2,7%	-	-	-	-
Всего: конечные точки	10/3 76,9%	50/62 44,6%	4,13	1,08-15,8	3,66	0,06

Среди генов-кандидатов, рассматриваемых вовлечёнными в риск развития ИБС, важное место занимает ген, кодирующий аполипопротеин Е [12]. Роль полиморфизма гена АпоЕ в возникновении и прогрессировании ИБС подтверждена результатами исследований, в которых выявлена связь аллеля ε4 с показателями заболеваемости и смертности от ИБС. В суб-исследовании, проводившемся в рамках многоцентрового скандинавского исследования 4S, было показано, что ε4-носительство встречалось у 36,5%, тогда как не-ε4 носителями были 63,5% обследованных пациентов, перенесших инфаркт миокарда [13]. При этом принимавшие плацебо ε4-носители имели почти вдвое более высокий риск смертности относительно не ε4-носителей (15,7% и 9%; RR 1,8, 95% СI: 1,1 – 3,1). В то же время в аналогичном по дизайну исследовании, проведенном в рамках GISSI-Prevenzione в Италии, среди пациентов, перенесших инфаркт миокарда, было всего лишь 16,8% ε4-носителей, а 83,2% оказались не-ε4 носителями. При этом было показано, что ε4-аллель является детерминантой положительного ответа на терапию правастатином в отношении выживаемости [14]. Результаты настоящего исследования подтвердили, что среди больных нестабильной стенокардией отмечается накопление «повреждающих» аллелей белков липидтранспортной системы, особенно у больных с семейным анамнезом ИБС. При годичном наблюдении отмечалась более высокая частота хирургических реваскуляризаций в группе больных с носительством «повреждающих» аллелей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наличие семейного анамнеза ИБС среди узбеков с нестабильной стенокардией ассоциируется с накоплением аллелей: «А» (М1-) G-A полиморфизма гена АпоА 1 и «ε4» гена AпоЕ. При этом среди носителей «повреждающих» аллелей отмечена более высокая частота хирургических реваскуляризаций в течение года.