Клинико-гематологические показатели и общее состояние крыс, получавших гексацианоферрат (II) калия-железа (III) в качестве сорбента радионуклидов

В условиях радиоактивного загрязнения территории одна из актуальных задач сельскохозяйственного производства — получение продукции животноводства (мясо, молоко), соответствующей санитарно-гигиеническим требованиям СанПин 2.3.2.1078-01 (1). Показано, что комплексное применение агротехнических и агромелиоративных мероприятий не позволяет более чем в 2,0-2,5 раза уменьшить переход 137Cs из рациона в молоко и мясо. В то же время использование сорбентов из класса ферроцин-содержащих препаратов (ФСП — ферроцин, бифеж, болюсы и брикеты соли-лизунца) способствует получению продукции, отвечающей принятым нормативам (2-5).

Поступление гексацианоферрата (II) калия-железа (III) (ферроци- на) с рационом в организм коров в дозах 6-24 мг/кг (3-12 г на 1 гол/сут) снижало содержание 137Cs в продуктах питания и не оказывало негативного влияния на состояние здоровья животных. Оценка клинико-физиологических и гематологических показателей, содержания метаболических гормонов, макро- и микроэлементов в плазме крови не выявила отклонений от контрольных значений (6-9). При исследовании ветеринарно-санитарных и санитарно-гигиенических показателей молока у коров, получавших ФСП, также не обнаружено различий по сравнению с контролем. В токсикологических экспериментах на крысах показано, что молоко от этих коров безвредно и может быть использовано без ограничений (10).

Аналогичные результаты получены на овцах, которым в течение 120 сут давали ферроцин в дозе 50 мг/кг (2 г на 1 гол/сут). В целях изучения возможности перехода железа в ткани органов за 3-4 сут до убоя в рацион животных включали ферроцин, меченный по 59Fe. В результате накопление 59Fe происходило только в ткани ребра и составило 0,22 % от введенной дозы (11).

Оценка эффективности сорбентов из класса ферроцинов в зависимости от формы соединения и дисперсности позволила отобрать ферроцианид железа с диаметром частиц 0,02-0,03 мм, поскольку при большей дисперсности (более 0,10 мм) препарат был менее эффективен (12). В настоящее время при ведении животноводства на радиоактивно загрязненных территориях успешно применяют фармакопейный ферроцин и фер-роцин-2 (ветеринарная форма сорбента) (Приказ Министра здравоохранения СССР ¹ 1253 от 25.12.1978 года. Фармакопейная статья ¹ 42-2В13-91. Ветеринарные правила 13.73.13. от 12.06.1999 года). Класс опасности и токсичности этих препаратов — соответственно 4-й и 5-й.

Следует отметить, что влияние сорбента мелкой дисперсности (диаметр частиц менее 0,02 и 0,03 мм) на состояние здоровья млекопитающих не изучено и его безопасные дозы не определены.

Научное обоснование оптимальных доз ферроцина мелкой дисперсности при скармливании животным предполагает исследование возможных токсических эффектов препарата, так как при поступлении в желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) он может сорбировать эссенциальные элементы, необходимые для организма.

Целью настоящей работы стало изучение влияния разных доз фер-роцина с диаметром частиц 0,002 мм на физиологическое состояние крыс.

Методика. Исследования проводили в виварии Всероссийского НИИ радиологии и агроэкологии на 20 крысах линии Вистар в возрасте 3 мес с живой массой 250±20 г. Содержание, кормление и уход осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 года ¹ 708 н). Крысы получали стандартный рацион (ООО «Лабораторкорм», Россия) и имели свободный доступ к воде. В состав корма входили злаки, мука рыбная, масло подсолнечное, витамины и минеральные соединения. Содержание основных компонентов корма было следующим: сырой протеин — 19 %, сырой жир — 5 %, сырая зола — 9 %, сырая клетчатка — 4 %, кальций — 1,8 %, фосфор — 1,1 %, витамин А — 5000 МЕ/кг, витамин D — 500 МЕ/кг, витамин Е — 4,8 МЕ/кг; влажность — 13,5 %.

Животных разделили на четыре группы по 5 особей в каждой. Контролем служила I группа. Крысы из II, III и IV групп в течение 30 сут получали с рационом соответственно 2,9; 5,8 и 8,1 мг ферроцина на 1 особь в сутки. Суточная доза препарата для животных из II группы составила

• 11,6; из III — 23,2; из IV — 32,4 мг/кг массы. Следует отметить, что в пересчете на 1 кг массы тела суточное поступление ферроцина с рационом 2,9 мг у крыс (живая масса 250 г) и 6,0 г у коров (живая масса 500 кг) сопоставимо. В эксперименте использовали ферроцин (лазурь железная милори) с диаметром частиц 0,002 мм, который состоял из железо-гекса-цианоферрата калия KFe[Fe(CN) 6 ] (5 %) и железо-гексацианоферрата Fe[Fe(CN) 6 ] (95 %). Препарат представлял собой мелкодисперсный порошок темно-синего цвета, без запаха, практически нерастворимый в воде, спирте, эфире. Образцы крови и органов у крыс отбирали на 30-е сут исследования под эфирным наркозом.

Влияние ферроцина на состояние здоровья животных оценивали на основании следующих биологических показателей: количество гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов в периферической крови, морфологический состав лейкоцитов (13), содержание SH-групп, белка и процентное соотношение его фракций в плазме крови (13-15), концентрация малонового диальдегида (МДА), активность каталазы (КАТ) и супероксид-дисмутазы (СОД) в плазме и эритроцитах периферической крови (16-18), синтез ДНК (общий и репаративный) и содержание металлотионеинов (МТ) в лимфоцитах селезенки (19-21), клеточность и индекс массы органов (печень, почки, селезенка) (22). Кроме того, учитывали общее состояние крыс, их аппетит, реакцию на внешние раздражители и функциональное состояние ЖКТ.

Плазму периферической крови и лимфоциты селезенки получали общепринятыми методами (13, 23). Жизнеспособность лимфоцитов определяли в тесте с трипановым синим.

Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t -критерия Стьюдента. Различия значений считали достоверными при p < 0,05 (24).

Результаты . Определение количества гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов в периферической крови у крыс из подопытных групп не выявило достоверных отличий от контроля (табл. 1). Тенденцию к увеличению содержания гемоглобина и эритроцитов отмечали у животных из IV группы, которые с рационом получали ферроцин в дозе 32,4 мг/кг. По морфологическому составу лейкоцитов, общему состоянию животных, по-едаемости корма, реакции на внешние раздражители и функциональному состоянию ЖКТ различий между подопытными и контрольной группами обнаружено не было.

1. Количество гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов в периферической крови у крыс линии Вистар при поступлении с рационом разных доз ферроцина с диаметром частиц 0,002 мм ( M ± m , лабораторный опыт)

Группа	^ Лейкоциты, тыс/мкл	Эритроциты, млн/мкл	Гемоглобин, г/л
I	6,8±0,9	10,0±0,9	168,4±5,7
II	5,9±1,1	11,6±1,2	164,9±6,4
III	5,0±1,1	9,6±0,8	165,6±14,1
IV	6,5±1,9	12,5±1,3	178,0±2,1
П р и м е ч а	н и е. Описание групп см. в разделе «Методика».

Содержание белка в плазме периферической крови животных из подопытных групп возрастало (табл. 2). Достоверные различия по сравнению с контролем наблюдали у крыс из III группы, которые получали фер-роцин в дозе 23,2 мг/кг. Анализ процентного соотношения фракций белка выявил уменьшение доли альбумина: у животных из III и IV групп значения показателя были ниже, чем у крыс из I группы, соответственно на 32 (p < 0,05) и 37 % (p <0 ,05). При этом количество α-, β- и γ-глобулинов в плазме крови у подопытных животных имело тенденцию к повышению, а альбумин-глобулиновое соотношение было достоверно ниже контроля.

2. Содержание (%) белка и его фракций в плазме крови у крыс линии Вис-тар при поступлении с рационом разных доз ферроцина с диаметром частиц 0,002 мм ( M ± m , лабораторный опыт)

Группа	Общий белок, мг/мл	Альбумин	α -Глобулин	β -Глобулин	γ -Глобулин	Альбумин/гло-булины
I	73,9±5,2	29,2±2,1	19,2±3,9	18,8±3,6	35,5±4,1	0,43±0,05
II	82,2±5,3	25,4±3,2	23,9±4,3	21,4±5,1	41,4±3,3	0,35±0,06
III	118,7±14,0*	19,9±3,0*	24,4±1,8	22,8±3,9	40,3±3,1	0,25±0,04*
IV	95,0±9,1	18,3±3,1*	25,4±1,3	19,0±2,8	37,3±2,8	0,23±0,05*
П р и м е ч а н и е. Описание групп см. в разделе «Методика». * Различия достоверны относительно контроля при p < 0,05.

Следовательно, увеличение содержания общего белка в плазме периферической крови у подопытных крыс происходило за счет фракций α -, β - и γ -глобулинов. Уменьшение количества альбумина в плазме крови и альбумин-глобулинового соотношения может свидетельствовать о формировании негативных реакций в организме животных из III и IV групп. В целом, увеличение общего содержания белка в плазме крови за счет фракции глобулинов при одновременном снижении доли альбумина дает основание предположить развитие токсикоза у животных по биохимическим показателям при отсутствии клинических признаков заболевания (9).

Оценка показателей, характеризующих процесс свободнорадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ) в организме крыс, позволила выявить следующие особенности. Концентрация МДА в плазме периферической крови у подопытных животных не отличалась от контрольных значений (табл. 3). Возможно, это было обусловлено активностью ферментов антиоксидантной защиты, к числу которых относят СОД и КАТ. Общеизвестно, что СОД служит ключевым ферментом антиоксидантной защиты и встречается во всех типах клеток млекопитающих. Фермент взаимодействует с супероксидным анион-радикалом, образуя пероксид водорода, и тем самым препятствует восстановлению ионов Fe³⁺ до Fe²⁺. Следует отметить, что ионы Fe²⁺ в реакции с пероксидом водорода и гипохлоритом образуют радикалы гидроксила (НО ^• ), которые химически активны и вызывают повреждение белков, нуклеиновых кислот и липидов клеточных мембран. В то же время каталаза (гемсодержащий фермент) разлагает пероксид водорода на воду и молекулярный кислород (25-27).

3. Содержание малонового диальдегида (МДА) , SH-групп и активность су-пероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ) в плазме периферической крови у крыс линии Вистар при поступлении с рационом разных доз ферроцина с диаметром частиц 0,002 мм ( M ± m , лабораторный опыт)

Группа	МДА, нмоль/мл	Активность СОД, %	Активность КАТ, мкмоль H2O2/(с•мл)	SH-группы, моль/105 г белка
I	4,20±0,12	32,60±2,19	1,50±0,05	0,72±0,08
II	4,14±0,03	31,30±1,18	1,60±0,01	0,68±0,07
III	4,16±0,08	35,14±2,50	1,20±0,20	0,36±0,05*
IV                 4,00±0,05         43,30±2,60*            1,10±0,15 П р и м е ч а н и е. Описание групп см. в разделе «Методика». * Различия достоверны относительно контроля при p < 0,05.				0,32±0,04*

Определение активности КАТ в плазме периферической крови у подопытных крыс выявило тенденцию к снижению значений этого показателя (табл. 3). Напротив, активность СОД возрастала. Достоверные различия относительно контроля регистрировали у крыс из IV группы. Возможно, активность КАТ зависит от количества пероксида водорода: при низких его значениях она снижается, а при высоких — повышается. В то 240

же время СОД активируется при образовании супероксидного анион-радикала. Кроме того, в каталитических центрах СОД присутствуют ионы Cu2+, Zn2+, Mg2+, а в КАТ — ионы Fe2+, поэтому модификацию их активности можно объяснить избытком или дефицитом этих элементов. В плазме периферической крови у животных, которые с рационом получали ферроцин, снижалось содержание SH-групп белков (см. табл. 3). Достоверные отличия значений от контрольных регистрировали у крыс из III и IV групп.

Оценка интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ в эритроцитах периферической крови у подопытных крыс обнаружила более выраженный характер изменений (табл. 4). Так, содержание МДА у крыс из III и IV групп было ниже, чем у животных из I группы, и составило 52 % относительно контроля (p < 0,05). Очевидно, что уменьшение количества МДА было обусловлено активностью ферментов антиоксидантной защиты (СОД и КАТ). Активность СОД в эритроцитах периферической крови у крыс из III и IV групп возрастала соответственно на 68,6 % (р < 0,05) и 109,9 % (р < 0,05), КАТ — на 59,0 % (р < 0,05) и 76,0 % (р < 0,05) по сравнению с контролем.

Вероятно, изменения количества МДА и активности СОД и КАТ в эритроцитах периферической крови животных из III и IV групп отражают развитие защитно-компенсаторных реакций в организме.

4. Содержание малонового диальдегида (МДА) и активность супероксид-дисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ) в эритроцитах периферической крови у крыс линии Вистар при поступлении с рационом разных доз ферроци-на с диаметром частиц 0,002 мм ( M ± m , лабораторный опыт)

Группа	МДА, пмоль/кл.	п Активность СОД, %1Активность КАТ, пмоль Н2О2/(с•кл.)
I	7,3±0,9	11,8±1,0	305,2±58,5
II	6,0±0,3	11,8±1,6	317,3±44,0
III	3,8±0,4*	19,9±1,5*	484,9±38,5*
IV                    3,8±0,4*               24,7±2,7* П р и м е ч а н и е. Описание групп см. в разделе «Методика». * Различия достоверны относительно контроля при p < 0,05.			535,6±61,0*

5. Функциональное состояние и жизнеспособность лимфоцитов селезенки у крыс линии Вистар при поступлении с рационом разных доз ферроцина с диаметром частиц 0,002 мм ( M ± m , лабораторный опыт)

Группа	Синтез ДНК, имп•мин-1•млн кл.-1		Содержание металло-тионеинов, нг/107 кл.	Жизнеспособность клеток, %
	общий	репаративный
I	124,3±6,6	71,2±4,5	180,7±61,0	95,2±1,3
II	103,0±7,5	65,9±4,3	156,6±33,8	96,8±0,2
III	153,6±3,1*	86,8±6,5	158,8±43,5	95,8±0,8
IV             175,0±6,0*           106,5±7,4*              280,9±27,7* П р и м е ч а н и е. Описание групп см. в разделе «Методика». *Различия достоверны относительно контроля при p < 0,05.				96,1±0,5

Функциональное состояние лимфоцитов селезенки у крыс оценивали по содержанию МТ и синтезу ДНК (общему и репаративному). МТ — низкомолекулярные белки (6-7 кДа), которые связывают ионы тяжелых металлов и действуют как ловушка для свободных радикалов (28, 29). Содержание МТ в лимфоцитах селезенки у крыс из II и III групп имело тенденцию к снижению, а у животных из IV группы, напротив, достоверно возрастало на 55 % (табл. 5). Очевидно, что ежедневное поступление фер-роцина в организм крыс в дозе 32,4 мг/кг индуцировало синтез МТ в клетках. Мы предполагаем, что повышение количества МТ в лимфоцитах селезенки было связано с образованием свободных радикалов и свидетельствовало о формировании адаптивно-защитных реакций организма.

При исследовании синтеза ДНК в лимфоцитах селезенки также об- наружили достоверное увеличение значений этого показателя у животных из III и IV групп соответственно на 24 и 41 %, причем усиление синтеза ДНК в клетках происходило за счет активации репаративных процессов. Достоверные различия относительно контроля отмечали у крыс из IV группы.

Следовательно, ежедневное поступление ферроцина с рационом в дозах 23,2 и 32,4 мг/кг приводило к изменению функционального состояния лимфоцитов селезенки при отсутствии отклонений от контрольных значений по показателям жизнеспособности. Выявленные изменения, в частности активация репаративного синтеза ДНК, свидетельствуют о развитии компенсаторных процессов в клетках.

Число клеток в селезенке достоверно снижалось у крыс из III и IV групп соответственно на 31 и 29 % (табл. 6). При этом клеточность органов выделения и детоксикации (печень и почки) достоверно не отличалась от контроля. Вероятно, клетки печени и почек по сравнению со сплено-цитами более устойчивы к воздействию токсичных элементов. Кроме того, селезенка как орган кроветворения обеспечивает гомеостаз клеточных популяций в периферической крови. Определение индекса массы органов (печень, почка, селезенка) не выявило существенных отклонений относительно контроля (см. табл. 6). Сравнительный анализ данных по клеточно-сти и индексу массы органов (в частности уменьшение числа лимфоцитов селезенки при отсутствии изменений индекса ее массы) позволил предположить развитие негативных процессов в организме.

6. Клеточность и индекс массы органов у крыс линии Вистар при поступлении с рационом разных доз ферроцина с диаметром частиц 0,002 мм ( M ± m , лабораторный опыт)

Группа	Орган
	печень	почки	селезенка
	Клеточ	н о ст ь, кл/мг т к а ни
I	54142±3650	129201±7971	365809±28979
II	60144±5613	130680±9179	292844±27141
III	50437±3906	129428±5898	252827±11075*
IV	59565±3473	111065±6008	261201±23949*
	Инд екс м ас сы органа, отн. ед.
I	0,0288±0,0011	0,0061±0,0001	0,0036±0,0002
II	0,0272±0,0010	0,0060±0,0001	0,0036±0,0003
III	0,0289±0,0014	0,0060±0,0002	0,0037±0,0002
IV	0,0289±0,0005	0,0063±0,0001	0,0038±0,0002
П р и м е ч а н и	е. Описание групп см. в разделе «Методика».
* Различия достоверны относительно контроля при p < 0,05.

Таким образом, для крыс линии Вистар оптимальная суточная доза ферроцина с диаметром частиц 0,002 мм составляет 11,6 мг/кг. С увеличением дозы препарата в рационе (суточные дозы 23,2 и 32,4 мг/кг) происходит развитие защитно-компенсаторных, а в ряде случаев и негативных реакций. Так, увеличение общего содержания белка в плазме крови за счет фракции глобулинов при одновременном снижении концентрации альбумина свидетельствует о развитии токсикоза у животных при отсутствии клинических признаков заболевания. Вероятно, в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) ферроцин в дозах 23,2 и 32,4 мг/кг связывает большее количество макро- и микроэлементов, что сказывается на ответной реакции организма. Однако снижение клеточности селезенки сложно объяснить их дефицитом. Возможно, в ЖКТ при поступлении ферроцина с рационом происходит всасывание растворимых солей железа, действие которых проявляется только при больших дозах. Об этом свидетельствует тенденция к увеличению количества гемоглобина и эритроцитов в периферической крови крыс, которые ежедневно с рационом получали ферроцин в дозе 32,4 мг/кг. В лимфоцитах селезенки на фоне уменьшения клеточно- сти органа регистрировали активацию синтеза ДНК и интенсивности репаративных процессов. По клинико-гематологическим и физиологическим показателям (общему состоянию, поедаемости корма, реакции на внешние раздражители и функциональному состоянию ЖКТ) различий между опытными и контрольной группами крыс не обнаружено.

Л И Т Е Р А Т У Р А

Sel’skokhozyaistvennaya biologiya / Agricultural Biology , 2015, V. 50, ¹ 2, pp. 237-244

THE INFLUENCE OF HEXACYANOFERRATE (II) POTASSIUM-FERRIC (III) AS A RADIONUCLIDE SORBENT FED AT DIFFERENT DOSES ON CLINICAL, HEMATOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL PARAMETERS IN RATS

E.B. Mirzoev, V.О. Kobyalko, N.N. Isamov (Jr.), O.A. Gubina, N.A. Frolova