Клинико-морфологические аспекты применения измельчённых слайсов пантов марала в лечении асептических ран мягких тканей

Лечение ран мягких тканей остаются одной из актуальных проблем современной хирургии [1–3]. Несмотря на большое разнообразие способов их лечения и лекарственных препаратов, применяемых для ускорения течение процессов регенерации, данная проблема остается не до конца решенной. На скорость репаративных процессов влияет значительное количество факторов, таких как возраст, вес, сопутствующие заболевания, характер травмы и проводимое лечение. При наличии инфицирования ран мягких тканей значительно увеличиваются длительность пребывания больного в стационаре, стоимость лечения, количество потенциальных хирургических манипуляций, возрастает частота инвалидизации, а также сроки временной нетрудоспособности [4, 5].

На сегодняшний день известны различные способы лечения ран мягких тканей, основанные на физических, химических, биологических и других способах воздействия на раневую поверхность. Рядом авторов отмечена высокая эффективность применения биологически активных препаратов, например, обогащенной тромбоцитами аутоплазмы [6–9]. К одной из причин ее эффективности можно отнести высокое содержание факторов роста, таких как тромбоцитарный (PDGF), трансформирующий (TGF-β), сосудистый эндотелиальный (VEGD), эпидермальный (EGF), инсулиноподобный (IGF) и др. [10].

Панты марала представляют собой неокостеневшие рога марала, собираемые в период их активного роста. В их состав входят IGF-I, IGF-II, TGF-β, EGF, витамины – ретинол, токоферол, витамины групп В, РР, аминокислоты, липиды, простогландины А, В, Е, F, а также эстрогены (эстрадиол, эстрон и эстриол) и андрогены (тестостерон и андростерон) [11–15]. Биохимический состав пантов марала позволяет предположить возможность их использования в качестве нового лекарственного средства, стимулятора репаративных процессов в мягких тканях.

Цель исследования. Изучить воздействие измельченных слайсов пантов марала на течение раневого процесса в лечении асептических ран мягких тканей в эксперименте.

Материалы и методы

Исследование проведено на базе Научно-исследовательского института экспериментальной биологии и медицины ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России на 90 крысах линии Wistar в 3-х группах. В первой контрольной группе лечения не проводили. Во второй выполнялись ежедневные перевязки с 0,01 % раствором бензилдиметил-миристоилами- но-пропиламмони я (БМП). В опытной группе – аналогичные перевязки были дополнены нанесением измельченных слайсов пантов марала с размером частиц 200 – 300 мкм в дозировке 400 мг/см² (табл. 1)

Таблица 1

Характеристика групп исследования

Table 1

Characteristics of research groups

Группа Исследования/ Research Group	Количество Животных/ Number of animals	Характеристика группы/ Characteristics of the group
1-я контрольная/ 1st control	30	Без лечения/ Without treatment
2-я контрольная/ 2nd control	30	Проведение перевязок с БМП 0,01 %/ Carrying out bandages with BMP 0.01 %
Опытная / Experimental	30	Проведение перевязок с БМП 0,01 % + нанесение измельченных слайсов пантов марала/ Carrying out bandages with BMP 0.01 % + applying crushed slices of maral antlers

Моделирование ран мягких тканей проводили по стандартной методике. Под ингаляционным наркозом изофлураном (дозировка при индукции 3–5 %, для поддержания 1,5–3 %) проводили выбривание шерсти животного в области холки. После двукратной обработки зоны моделирования 0,01 % раствором БМП, скальпелем по пластиковому шаблону круглой формы диаметром 1,5 см иссекали мягкие ткани и поверхностную фасцию. Полученную рану промывали 10 мл 0,9 % раствора NaCl и сразу начинали лечение в соответствии с характеристикой группы. Раневую поверхность по окончанию перевязки закрывали лейкопластырной повязкой.

После моделирования животные помещались в индивидуальные клетки с одинаковыми условиями питания и ухода.

Изучение эффективности использования измельченных слайсов пантов в лечении асептических ран мягких тканей про- водили с использованием объективных (состояние шерстного покрова, наличие болезненности при пальпации, отечности и гиперемии мягких тканей, количество и характер отделяемого, вес животного), гистологических и гистохимических (окрашивание растворами гематоксилина и эозина, по Гимзе, импрегнация серебром и толуидиновым синим, иммуногистохимическое окрашивание антителами CD-68 и CD163), метрических, в том числе планиметрических (ежедневное определение площади раневой поверхности) и морфометрических методик (количество новообразованных сосудов, количество тучных клеток и коллагеновых волокон).

Вывод животных из эксперимента и забор биологического материала для гистологического и гистохимического исследований проводился на 1, 3, 5, 7 и 14 сутки после моделирования.

Животные были стандартизированы по полу, возрасту и массе тела.

Исследование проведено в строгом соответствии с требованиями ФЗ РФ от 14.05.1993 N 4979-1 «О ветеринарии» (с изменениями от 02.07.21); Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза «О защите животных, используемых в научных целях»; ГОСТа № 332162014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами» и других документов.

Для проведения статистической обработки полученных данных проводилась проверка нормальности распределения и использовались методы описательной статистики – расчет среднего значения полученных результатов, ошибки среднего в пределах исследуемых групп. Для определения достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента в группах с нормальным распределением, Манна-Уитни в группах, где распределение не соответствовало нормальному. Уровень значимости принят за 5 % (p<0,05). Обработка данных проведена с использованием пакетов прикладных программ “Statictica 10.0” и “Microsoft Office Excel 2010”.

Результаты

При изучении местных признаков воспаления получены следующие результаты (табл. 2). Отечность и гиперемия мягких тканей достоверно купировались на 17,5 % и 14,8 % быстрее в опытной группе по сравнению с 2-й контрольной группой. Снижение отделяемого ран до скудного в группе, где лечения не проводилось (1-я контрольная группа) наблюдалось на 3,8±0,3 сутки, в опытной – на 2,5±0,2 сутки исследования.

Средняя площадь раневой поверхности после моделирования составила 6,4±135,7 мм. В -1й контрольной группе площадь раны сократилась на -1е сутки от начала исследования на 29,91 %, на 3-и сутки – 60,78 %, на 5-е сутки – 71,26 %, на 7-е сутки – 87,24 % и на -14е сутки – на 93,84 % (табл. 3). Во второй контрольной группе аналогичный показатель в указанные сроки уменьшился на 36,14 %, 68,11 %, 75,44 %, 87,24 % и 97,43 %.

При применении измельченных слайсов марала в опытной группе получены следующие данные: на 1-е сутки площадь раневого дефекта снизилась на 40,54 %, к 3-м суткам – 70,97 %, к 5-м суткам – 82,84 %, к 7-м суткам – 90,84 %, на 14-е сутки исследования – 99,41 %.

Таблица 2

Сроки купирования местных признаков воспаления в исследуемых группах животных, сутки

Table 2

Time of relief of local signs of inflammation in the studied groups of animals, day

Группа исследования/ Research Group	Сроки купирования местных признаков воспаления/ The timing of relief of local signs of inflammation
	Отек кожи/ Swelling of the skin	Гиперемия кожи/ Hyperemia of the skin	Отделяемое ран/ Exudation of the wound *
1-я контрольная/ 1st control	3,5±0,3	2,8±0,3	3,8±0,3
2-я контрольная/ 2nd control	2,9±0,31	2,7±0,2	2,8±0,31
Опытная / Experimental	2,4±0,21	2,3±0,21	2,5±0,21

1 - достоверность различий по сравнению с 1-й контрольной группой, р<0,05

* – уменьшение отделяемого до скудного количества

При исследовании морфологического материала дермы кожи крыс опытной группы на 3-и сутки с окраской раствором Гимза визуализируется умеренная отечность стромы, большое количество солокализованных тучных клеток с ретикулярными и коллагеновыми волокнами, в то время как 1-й контрольной группе отмечаются ярко выраженные признаки острого воспаления, плотный воспалительный инфильтрат, включающий нейтрофильный и эозинофильные гранулоциты.

На 5-е сутки на фоне проведения перевязок (2-я контрольная группа) отмечается формирование грануляционной ткани, представленной в виде отдельных островков роста в сетчатом слое дермы кожи. В опытной группе в указанный срок волокнистые компоненты соединительнотканной стромы дермы организуют сеть фибрилл с четко упорядоченной ячеистой структурой, в дерме кожи в области раны преобладают представители фибробластического дифферона.

На 7-е сутки в контрольных группах сохраняются остаточные признаки воспаления в виде очаговой инфильтрации гранулоцитами. В 1-й контрольной группе соединительнотканный компонент представлен тонкими ретикулярными волокнами, во 2-й контрольной – зрелыми коллагеновыми волокнами.

Таблица 3

Динамика площади раневого дефекта в исследуемых группах животных, мм2

Table 3

Dynamics of the wound defect area in the studied groups of animals, mm2

Группа исследования/ Research Group	Сразу после моделирования/ Immediately after the simulation	Площадь ран мягких тканей, мм2 / The area of soft tissue wounds, mm2
		1 сутки/ 1 day	3 сутки/ 3 day	5 сутки/ 5 day	7 сутки/ 7 day	14 сутки/ 14 day
1-я контрольная/ 1st control	136,4±6,2	95,6± 5,9	53,5± 5,71	39,2± 4,91	23,1± 3,81	8,4± 1,51
2-я контрольная/ 2nd control	134,9±6,4	87,1± 6,1	43,5± 5,6 1,2	33,5± 5,3 1,2	17,4± 2,6 1,2	3,5± 1,7 1,2
Опытная / Experimental	135,3±6,4	81,1± 5,3	39,6± 5,11,2	23,4± 4,9 1,2,3	12,5± 2,71,2	0,8± 0,3 1,2,3

1 – достоверность различий по сравнению с -1и сутками, р<0,05 2 – достоверность различий по сравнению с -1й контрольной группой, р<0,05

3 – достоверность различий по сравнению с -2й контрольной группой, р<0,05

На 14-е сутки в опытной группе отмечается строгая упорядоченность соединительнотканных тяжей одинаковой толщины, морфологическая картина соответствует здоровой коже, область раны реэпителизирована. Во 2-й контрольной группе сохраняется упорядоченная структура, однако обращает на себя внимание разная толщина волокон. В 1-й контрольной группе волокна хаотично расположены, как и окружающие их беспорядочно расположенные элементы капиллярного русла. В группах без лечения и с применением перевязок (1-я и 2-я контрольные группы) эпидермис сформирован не полностью, граница между ним и дермой выражена не четко.

Также исследована динамика основных клеточных элементов в течении исследуемого раневого процесса (табл. 4 и 5). Количество тучных клеток в опытной группе при применении измельченных слайсов пантов марала показывает снижение на 5-е сутки 68,1±5,3 клеток на мм2, что может свидетельствовать о снижении компенсаторных воспалительных реакций раневого процесса, по сравнению с 1-й и 2-й контрольными группами, где данный показатель составил

89,6±7,5 и 81,2±7,3, соответственно. Аналогичную динамику имеет воспалительный инфильтрат в границах зоны раневого дефекта и окружающих тканях.

Таблица 4

Динамика клеточных элементов в группах исследования в проекции зоны раневого дефекта, ед. на 1 мм2

Table 4

Dynamics of cellular elements in the study groups in the projection of the wound defect zone, units per 1 mm2

Сутки исследования/ Day of research	Группы исследования/ Research groups	Количество тучных клеток/ The number of mast cells	Клетки фибробластического дифферона/ Fibroblastic differon cells
3-и сутки/ 3 day	1-я контрольная/ 1st control	94,7±5,2	15±4,1
	2-я контрольная/ 2nd control	89,5±3,4*	19±3,9*
	Опытная / Experimental	81,2±4,1*	26±3,7*
5-е сутки/ 5 day	1-я контрольная/ 1st control	89,6±7,5	28±6,5
	2-я контрольная/ 2nd control	81,2±7,3*	31±4,4*
	Опытная / Experimental	68,1±5,3*	42±5,2*
7-е сутки/ 7 day	1-я контрольная/ 1st control	79,2±4,3	40±4,9
	2-я контрольная/ 2nd control	74,3±3,5*	38±2,2*
	Опытная / Experimental	61,7±4,2*	35±2,6*
14-е сутки/ 14 day	1-я контрольная/ 1st control	67±3,4	22±3,6
	2-я контрольная/ 2nd control	59±2,3*	17±3,1*
	Опытная / Experimental	54,2±2,7*	12±1,9*

– достоверность различий -1й контрольной группой, p<0,05

Максимальные значения количества тучных клеток получены на 3-и сутки в период I-й фазы раневого процесса, свидетельствующие об активном воспалительном процессе в мягких тканях, в 1-й контрольной группе данный показатель составил 112±9,6, во 2-й контрольной – 95±7,2, в опытной – 74±8,4 на 1 мм2. К концу исследования в опытной группе инфильтрат практически не определяется – регистрируются единичные нейтрофилы и эозинофилов в полях зрения, в 1-й контрольной группе – 20±5,8, во 2-й контрольной – 15±4,2, что говорит о неполном процессе формирования клеточной архитектоники и ремоделирования ткани. Процессы трансформации клеток фибробластического дифферона и образования коллагеновых волокон наиболее активно проходят в группе с применением измельченных слайсов пантов марала – пиковое значение клеток фибробластического дифферона регистрируется на 5-е сутки 42±5,2 и снижается до конца исследования, на 7-е сутки – 35±2,6, на 14-е – 12±1,9. Рост объема волокон соединительной ткани диаметром более 1 мм в опытной группе в среднем происходит в 1,47 раз быстрее на всех сроках исследования по сравнению с 1-й контрольной группой.

Таблица 5

Динамика клеточных элементов в проекции зоны раневого дефекта и окружающих тканях

Table 5

Dynamics of cellular elements in the projection of the wound defect zone and surrounding tissues

Сутки исследования/ Day of research	Группы исследования/ Research groups	Воспалительный инфильтрат, на 1 мм2/ Inflammatory infiltrate, per 1 mm2	Волокна соединительной ткани диаметром более 1мкм, % / Connective tissue fibers with a diameter of more than 1 microns, %
3-и сутки/ 3 day	1-я контрольная/ 1st control	112±9,6	7,2±0,6
	2-я контрольная/ 2nd control	95±7,2*	8,1±0,3*
	Опытная / Experimental	74±8,4*	8,4±0,3*

Продолжение Таблиы 5

5-е сутки/ 5 day	1-я контрольная/ 1st control	98±6,5	12,6±0,4
	2-я контрольная/ 2nd control	67±4,7*	14,1±0,5*
	Опытная / Experimental	41±5,2*	17,8±0,4*
7-е сутки/ 7 day	1-я контрольная/ 1st control	61±4,8	21,2±0,3
	2-я контрольная/ 2nd control	44±5,1*	28,9±0,2*
	Опытная / Experimental	37±3,4*	34,5±0,4*
14-е сутки/ 14 day	1-я контрольная/ 1st control	20±5,8	52,3±0,2
	2-я контрольная/ 2nd control	15±4,2	68,8±0,2*
	Опытная / Experimental	единичные в поле зрения/ single ones in the field of view	87,4±0,4*

– достоверность различий 1-й контрольной группой, p<0,05

Заключение

Таким образом, анализ данных объективных и морфологических методов исследования показал, что применение измельченных слайсов пантов марала ведет к полноценному восстановлению дермы кожи крыс при лечении ран мягких тканей, ускорению купирования местных признаков воспаления по сравнению с 1-й контрольной группой на 27,8 %, сокращению исходной площади раневой поверхности в среднем до 99,41 % на 14-е сутки исследования. Морфологическая картина свидетельствует о комплексном воздействии измельченных слайсов пантов марала на всех этапах процесса регенерации, что отражается в большей активации клеточных элементов, раннем очищении и восстановлении гистоархитектоники кожи по сравнению с группами контроля.