Клинико-морфологическое исследование миелофиброза при хроническом миелолейкозе

В настоящее время во всем мире сохраняется тенденция к увеличению заболеваемости гемобластозами, в том числе и хроническим миелолейкозом (ХМЛ). Ежегодная заболеваемость ХМЛ варьирует от 0,6 до 1,9 случая на 100 000 населения [1]. Важное значение для диагностики и установления клинической фазы ХМЛ имеет гистологическое исследование костного мозга, которое позволяет оценить степень выраженности фиброзной ткани и наличие скоплений бластных клеток, что может быть ранним проявлением прогрессирующей фазы заболевания и бластного криза [2]. Повышенное количество ретикулиновых волокон, выявляемых методом серебрения, в момент установления диагноза определяется у 40 % больных. Увеличение количества ретикулиновых волокон в костном мозге коррелирует с увеличением количества мегакариоцитов, выраженностью спленомегалии и анемии [10]. Однако морфологическое исследование костного мозга не включается в прогностическую систему, так как основное внимание сфокусировано на гематологических параметрах [11]. В то же время, как считают некоторые исследователи, гистологические характеристики являются важными прогностическими признаками в прогрессировании хронической фазы ХМЛ [12].

По одним данным, развитие миелофиброза (МФ) снижает риск развития бластного криза и ассоциировано с большей продолжительностью жизни [6]. Другие авторы считают, что у пациентов с большей плотностью ретикулиновых волокон восстановление кроветворения в период после трансплантации костного мозга протекает хуже, чем у больных с меньшим уровнем аналогичных показателей [12]. Таким образом, информация о прогностической значимости МФ противоречива. В частности, остается неясным: влияет ли объем опухолевой массы в костном мозге, гистологический подтип опухолевого поражения на распространённость МФ при ХМЛ. Вопрос о влиянии современной химиотерапии на МФ при этом заболевании также недостаточно освещен.

Цель исследования – изучить патоморфоло-гические особенности МФ при ХМЛ и оценить влияние опухолевого поражения костного мозга и химиотерапии (ХТ) на его выраженность.

Материал и методы

Обследовано 88 больных ХМЛ, из них 52 мужчины и 36 женщин, в возрасте от 16 до 82 лет (средний возраст – 55,8 ± 1,9 года), находившихся на лечении в ГБУЗ НСО «Государственная Новоси- бирская областная клиническая больница» с 2006 по 2013 г. Исследование проведено с соблюдением «Этических принципов проведения научных медицинских исследований с участием человека» и в соответствии с «Правилами клинической практики в Российской Федерации».

Хроническая фаза ХМЛ встречалась в 60 % случаев. Фазу акселерации и фазу бластного криза рассматривали в совокупности, в эту группу были включены 40 % пациентов. Дебют заболевания наблюдался в 47 % случаев, ответ на химиотерапию (оптимальный или субоптимальный) – в 22 %, рецидив – в 31 %. Одну линию химиотерапии (гидроксикарбамид + интерферон альфа-2β) получили 55 % больных, две (гидроксикарбамид + интерферон альфа-2β, иматиниб) – 45 % пациентов. Верификацию диагноза ХМЛ, определение фазы заболевания, оценку результатов терапии осуществляли согласно стандартным критериям [4, 5].

Степень МФ устанавливалась согласно шкале Европейского консенсуса [12]. Автоматизированное морфометрическое исследование МФ проводили с использованием программы анализа изображений AxioVision 4.6, камеры Axio Cam, микроскопа Zeiss, компьютера. На парафиновых срезах трепанобиоптатов подвздошной кости, толщиной 4 мкм, импрегнированных серебром по методу Гомори и окрашенных по методу ван Гизона при ×200, измеряли абсолютную площадь фиброзной ткани. Абсолютную площадь гемопоэтической и опухолевой ткани измеряли в срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Изучали все костномозговые полости одного среза, что соответствовало 5–7 полям зрения микроскопа и 20–30 полям зрения камеры (в зависимости от размера среза). Площадь одного поля зрения камеры составляла 364 000 мкм² (0,7 мм²). Подсчитывали суммарную абсолютную площадь фиброзной ткани в пределах одного среза, а также суммарную абсолютную площадь гемопоэтической и опухолевой ткани. Относительную площадь фиброзной и опухолевой ткани (S отн.фибр.тк. и S отн.опух.тк. ) вычисляли по формулам, описанн^. ым^. р^. анее [^. 3].^{. .}

Материалом для цитологического исследования служили мазки периферической крови и аспиратов костного мозга, окрашенные по методу Романовского – Гимзы.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы SPSS (версия 17.0). Результаты представлены в виде M ± σ, где М – среднее арифметическое значение, σ – стандартное отклонение. Проверку соответствия выборок анализируемых данных по Sотн.фибр.тк. и Sотн.опух.тк. нормальному закону распределения проводили по критерию Шапиро – Уилка. Сравнения средних значений различных выборок производили с помощью U-теста по методу Манна и Уитни (непараметрический тест). Связь между двумя переменными определяли с помощью коэффициентов корреля- ции Пирсона и Спирмана. Для однофакторного и многофакторного анализа использовали модель логистической регрессии. Критериями достоверности считали значения вероятности ошибки р<0,05 и отношения шансов (OR)>1,0.

Результаты и обсуждение

Характеристика МФ в дебюте и рецидиве заболевания

Частота МФ при ХМЛ составила 50 %. При этом у пациентов в фазе акселерации и фазе бластного криза МФ встречался чаще, чем у пациентов в хронической фазе ХМЛ (соответственно в 79 и 46 %) (рис. 1). Как начальный, так и выраженный МФ в хронической фазе, а также в фазе акселерации и фазе бластного криза наблюдались практически с одинаковой частотой – 30 % (рис. 2). Чаще определялось сочетание начального и выраженного МФ: в 40 % случаев у пациентов в хронической фазе и в 46 % случаев у пациентов в фазе акселерации и фазе бластного криза. У пациентов как в хронической фазе, так и в фазе акселерации и фазе бластного криза S_{отн.фибр.тк.} при выраженном МФ оказалась больше S_{отн.фибр.тк.} при начальном МФ (p<0,001) (табл. 1). В фа^.зе а^.кс^. елерации и фазе бластного криза S при выраженном МФ отн.фибр.тк.

достоверно (р12<0,001) превысила аналогичный показатель в хронической фазе.

Проанализирована взаимосвязь МФ и опухолевой ткани. Относительная площадь опухолевой ткани у пациентов в хронической фазе МФ составила 60,7 ± 18,8 % и не отличалась от аналогичного показателя у пациентов в фазе акселерации и фазе бластного криза (59,0 ± 18,7 %). У пациентов в хронической фазе ХМЛ гранулоцитарный подтип опухолевой инфильтрации костного мозга наблюдался в 2 раза чаще, чем гранулоцитарно-мегакариоцитарный – 69 % против 31 %.

При гранулоцитарном подтипе опухолевой инфильтрации костного мозга у пациентов в хронической фазе заболевания S при начальном МФ отн.фибр.тк.

и Sотн.фибр.тк. при выраженном МФ не различались, а при гранулоцитарно-мегакариоцитарном подтипе Sотн.фибр.тк. при выраженном МФ превысила Sотн.фибр.тк. при. нач. а.льном МФ (р<0,001) (табл. 2). У пацие. нто. в.

Рис. 1. Частота МФ при ХМЛ в хронической фазе, фазе акселерации и фазе бластного криза

Рис. 2. Структура МФ в хронической фазе, а также фазе акселерации и фазе бластного криза

с гранулоцитарно-мегакриоцитарным подтипом Sотн.фибр.тк. при выраженном МФ превысила анало-гич.ный. .показатель у больных гранулоцитарным подтипом (р=0,006 и р=0,017 соответственно).

В хроническую фазу ХМЛ, независимо от подтипа опухолевой инфильтрации костного мозга, обнаружена прямая корреляция между Sотн.фибр.тк. при начальном МФ и числом мегакариоцитов в трепанобиоптате подвздошной кости (r=0,619, р=0,032), между Sотн.фибр.тк. при начальном МФ и числом карликовых .мег. ак. ариоцитов в трепано- биоптате подвздошной кости (r=0,703, р=0,016), между Sотн.фибр.тк. при выраженном МФ и числом мегакариоц. ито. в. в трепанобиоптате подвздошной кости (r=0,517, р=0,006), между Sотн.фибр.тк. при выраженном МФ и числом карликовых м. ега. к.ариоцитов (r=0,643, р=0,014) в трепанобиоптате подвздошной кости.

В хронической фазе ХМЛ, независимо от подтипа опухолевой инфильтрации костного мозга у пациентов с дизмегакариоцитопоэзом, Sотн.фибр.тк. при начальном МФ и Sотнфибртк при выражен. ном. .МФ таблица 1

относительная площадь фиброзной ткани в трепанобиоптатах в хронической фазе, фазе акселерации и фазе бластного криза у пациентов с хМЛ

Фаза	S отн.фибр.тк. при начальном МФ	S отн.фибр.тк. при выраженном МФ
Хроническая (n=28)	17,7 ± 22,9	30,7 ± 32,6*
Акселерации и бластного криза (n=11)	18,8 ± 28,7	39,2 ± 40,5#
р	р1,2=0,650	р1,2<0,001

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с показателем в хронической фазе при начальном МФ (р<0,001); # – различия статистически значимы по сравнению с показателем в фазе акселерации и фазе бластного криза при начальном МФ (p<0,001).

таблица 2

относительная площадь фиброзной ткани в трепанобиоптатах при гранулоцитарном и гранулоцитарно-мегакариоцитарном подтипах хМЛ в хронической фазе заболевания

Тип ХМЛ	S отн.фибр.тк. при начальном МФ	S отн.фибр.тк. при выраженном МФ
Гранулоцитарный (n=31)	5,8 ± 14,2	5,9 ± 15,2
Гранулоцитарно-мегакариоцитарный (n=14)	11,3 ± 24,4	30,5 ± 41,5*
р	р1,2=0,310	р1,2=0,006

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с показателем при начальном МФ при гранулоцитарно-мегакариоцитарном типе (р<0,001).

таблица 3

относительная площадь фиброзной ткани в трепанобиоптатах при наличии и отсутствии дизмегакариоцитопоэза у пациентов в хронической фазе хМЛ

Дизмегакриоцитопоэз S отн.фибр.тк. при начальном МФ S отн.фибр.тк. при выраженном МФ Присутствует (n=15) 8,1 ± 18,1 17,8 ± 31,5 Отсутствует (n=16) 7,8 ± 31,5 13,2 ± 26,3 р р1,2=0,018 р1,2=0,005 оказались достоверно больше, чем аналогичные показатели у пациентов без дизмегакариоцитопоэ-за (р=0,018 и р=0,005 соответственно) (табл. 3).

В фазе акселерации и фазе бластного криза Sотн.фибр.тк. при выраженном МФ (21,4 ± 32,1 %) знач. им.о .больше (р=0,006), чем при начальном МФ (13,0 ± 23,4 %). При выраженном и при начальном МФ уровни Sотн.фибр.тк. прямо коррелировали с процентным содер.жан. и. ем бластов в миелограмме (r=0,414, p=0,014 и r=0,314, p=0,040 соответственно), в трепанобиоптатах подвздошной кости (r=0,311, p=0,046 и r=0,531, p=0,021 соответственно) и в периферической крови (r=0,437, p=0,025 и r=0,697, p=0,007).

Продолжительность заболевания с момента появления первых симптомов до момента постановки диагноза составила 7,5 ± 3,2 мес. Независимо от фазы ХМЛ обнаружена прямая корреляция между продолжительностью заболевания с момента появления первых жалоб до момента постановки диагноза и Sотн.фибр.тк. при начальном МФ (р=0,009, r=0,873), а так. же. п. родолжительностью заболевания и Sотн.фибр.тк. при выраженном МФ (р=0,015, r=0,702). На.чал.ьн. ый МФ ассоциирован с продолжительностью болезни более 4 мес (р=0,018, OR 59,13, 95 % CI 7,58 – 274,15), выраженный МФ – c продолжительностью ХМЛ более 7 мес (р=0,008, OR 85,09, 95 % CI 10,19 – 379,72).

Характеристика МФ у пациентов, ответивших на химиотерапию (оптимальный или субоптимальный ответ)

Группу пациентов, ответивших на лечение (оптимальный, субоптимальный ответ), составили 19 человек. Все пациенты получили две линии химиотерапии: гидроксикарбамид + интерферон альфа-2β, иматиниб.

Семь (54 %) человек из группы больных, у которых МФ отсутствовал на фоне проведенного лечения, не имели МФ изначально до химиотерапии. У 5 (38 %) человек присутствовал начальный МФ, у 1 (8 %) больного – выраженный (МФ-2). У пациентов, ответивших на химиотерапию, Sотн.фибр.тк. при выраженном МФ (20,1 ± 33,6 %) оказалась. зн.ач. имо больше, чем при начальном МФ (3,5 ± 8,6 %). У

13 (68 %) больных МФ отсутствовал. Наличие МФ отмечено у 6 (32 %) пациентов. Сочетание начального и выраженного МФ наблюдалось в 4 (21 %), только выраженный МФ – в 2 (11 %) случаях.

У пациентов, ответивших на ХТ, Sотн.фибр.тк. оценена в сравнении с Sотн.фибр.тк. у пациентов. в д.е.бюте и рецидиве заболевани. я. О. б. наружено, что самый большой уровень Sотн.фибр.тк. при начальном МФ отмечался у пациентов .с ре. ц.идивом ХМЛ (табл. 4). Значения Sотн.фибр.тк. при выраженном МФ у пациентов с рецидив. ом.Х.МЛ и у больных, ответивших на химиотерапию, значимо выше, чем у пациентов в дебюте заболевания.

Многофакторный анализ показал ассоциацию начального МФ в хронической фазе ХМЛ с такими факторами, как дизмегакариоцитопоэз (р=0,032, OR 69,43, 95 % CI 2,18 – 306,40) и гранулоцитарно-мегакариоцитарный тип опухолевого поражения костного мозга (р=0,046, OR 70,42, 95 % CI 3,99 – 215,18), выраженного МФ, с аналогичными факторами (р=0,006, OR 50,13, 95 % CI 4,85 – 372,10 и р=0,002, OR 16,32, 95 % CI 5,12 – 118,12 соответственно), а также с проводимой химиотерапией (гидроксикарбамид + интерферон альфа-2β, иматиниб).

Проведение многофакторного анализа обнаружило ассоциацию в фазе акселерации и фазе бластного криза начального МФ с числом незрелых клеток миелоидного ряда в трепанобиоптате подвздошной кости – 30 % и более, выраженного МФ – с числом незрелых клеток миелоидного ряда – 55 % и более.

Частота МФ при ХМЛ в нашем исследовании оказалась выше, чем в других работах [10]. Это связано с тем, что мы применяли иную методику оценки МФ. Помимо общепринятой шкалы Европейского консенсуса нами использована программа для морфометрического анализа изображений. Во внимание принимались не только срезы тре-панобиоптатов, по всей площади представленные фиброзными волокнами, но и те срезы, в которых наряду с участками, занятыми фиброзной тканью, отмечались поля костного мозга, свободные от ретикулиновых и коллагеновых волокон.

таблица 4

относительная площадь опухолевой и фиброзной ткани у пациентов в дебюте, рецидиве хМЛ и при ответе на химиотерапию

Фаза заболевания	S отн.опух.тк.	Sотн.фибр.тк. при начальном МФ	Sотнфибртк при выраженном ... МФ
Дебют (n=50)	62,2 ± 15,8	7,1 ± 15,4	14,8 ± 27,4*
Ответ на ХТ (n=13)	0	3,5 ± 8,6	20,1 ± 33,6**
Рецидив (n=19)	54,4 ± 25,8	19,0 ± 30,8	22,6 ± 35,7
р		р12<0,001 р1,3<0,001 р2,3<0,001	р12<0,001 р1,,3<0,001

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с показателями у больных ХМЛ с дебютом заболевания при начальном МФ (р<0,001); ** – различия статистически значимы по сравнению с показателями у пациентов с ответом на ХТ при МФ-2 (p<0,001).

Заключение

При ХМЛ миелофиброз встречается чаще в фазе акселерации и фазе бластного криза, чем в хронической фазе заболевания. В фазе акселерации и фазе бластного криза распространенность как начального, так и выраженного МФ прямо коррелирует с числом бластов как в костном мозге, так и в периферической крови. Проведение многофакторного анализа обнаружило ассоциацию в фазе акселерации и фазе бластного криза начального МФ с числом незрелых клеток миелоидного ряда в трепанобиоптате подвздошной кости – 30 % и более, выраженного МФ – с числом незрелых клеток миелоидного ряда – 55 % и более. Независимо от фазы ХМЛ распространенность как начального, так и выраженного МФ прямо коррелирует с продолжительностью заболевания. Эти факты объясняются тем, что естественное течение ХМЛ сопровождается увеличением содержания фиброзных волокон в костном мозге. Степень МФ отражает один из этапов развития, на котором было выявлено заболевание [8].

Распространенность выраженного МФ при гранулоцитарно-мегакариоцитарном подтипе выше, чем при гранулоцитарном подтипе. Независимо от подтипа опухолевого поражения костного мозга имеется прямая корреляция между распространенностью как начального, так и выраженного МФ и числом мегакариоцитов в трепанобиоптате подвздошной кости. При гранулоцитарном подтипе прямая корреляция наблюдается между распространенностью как начального, так и выраженного МФ и числом карликовых мегакариоцитов. Распространенность начального и выраженного МФ у па- циентов с дизмегакариоцитопоэзом больше, чем у пациентов без дизмегакариоцитопоэза. Многофакторный анализ выявил ассоциацию в хронической фазе ХМЛ как начального, так и выраженного МФ с такими факторами, как дизмегакариоцитопоэз и гранулоцитарно-мегакариоцитарный тип опухолевого поражения костного мозга.