Клональное микроразмножение форзиции свисающей (Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl.)

Введение . Форсайтии, форзиции или форсиции ( Forsythia Vahl.) – кустарники и небольшие деревья из семейства Маслинные. Род Форзиция включает 6 восточноазиатских и 1 юговосточноевропейский вид. Благодаря исключительной декоративности во время цветения, эти растения используют в одиночных и групповых посадках на газонах, в качестве компонента сложных композиций, а также для создания живых изгородей. Форзиция свисающая (Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl.) была завезена в Приморье из Китая. Она представляет собой кустарник высотой до 3 м с красивыми, дугообразно изогнутыми и очень гибкими побегами. Цветение начинается до появления листьев ранней весной и продолжается в течение 20–25 дней. Крупные колокольчатые золотисто-желтые, с оранжеватыми полосками цветки расположены по одному или группами по 3–6 штук и очень декоративны. Растет этот вид форзиции очень быстро, считается зимостойким и выносливым. Однако в средней полосе России растение требует зимнего укрытия или пригибания, так как происходит обмерзание его побегов, расположенных выше уровня снежного покрова [1, 2].

Форзиции, обладая высокой способностью к адвентивному корнеобразованию, легко размножаются вегетативно [2], тем не менее важное практическое значение имеет разработка методов размножения, в частности методами клонального микроразмножения, как правило, дающими высокий коэффициент мультипликации.

Цель исследования. Разработка процедуры эффективной поверхностной стерилизации эксплантов при введении в культуру in vitro , а также установление возможного коэффициента размножения форзиции свисающей.

Задачи: введение в культуру in vitro пазушных почек форзиции, получение стерильных побегов, их последующее черенкование и укоренение.

Материалы и методы. Для целей эксперимента в апреле 2014 г. в зеленых насаждениях г. Владивостока был отобран вегетативный материал форзиции свисающей в фазе начала вегетации. Поверхностная стерилизация выполнялась по схеме, применявшейся для вегетативного материала ряда растений, в том числе и древесных, отобранного в условиях естественных насаждений за пределами городской черты. Процедура включала 15-минутную экспозицию в 7%-м растворе гипохлорита натрия с последующим промыванием в проточной воде в течение 15 минут, затем 1,5-минутная экспозиция в 0,1 %-м диациде с 3-кратным промыванием стерильной водой в асептических условиях ламинарного бокса. После поверхностной стерилизации растительный материал до посадки на среду помещали в стерильные чашки Петри. Непосредственно перед посадкой в культуральные сосуды с питательной средой выполнялась обрезка частей эксплантов, поврежденных при стерилизации.

На этапе введения в культуру использовали две питательные среды следующего состава:

• -    макросоли, микросоли и хелат железа по WPM [3]; витамины: В1 – 2 мг/л, В6 – 1 мг/л, РР – 1 мг/л, инозитол – 200 мг/л; аминокислоты: глицин – 4 мг/л, глутамин – 4 мг/л; фитогормоны: 6 БАП – 1 мг/л, НУК – 0,1 мг/л;

• -    макросоли, микросоли и хелат железа по MS [3]; витамины: тиамин – 1 мг/л, пиридоксин – 0,5 мг/л, никотиновая кислота – 0,5 мг/л, аскорбиновая кислота – 1 мг/л, инозитол – 200 мг/л; аминокислоты: глицин – 4 мг/л, глутамин – 4 мг/л: фитогормоны: 6БАП – 1 мг/л, ИУК – 0,1 мг/л, кинетин – 0,1 мг/л. Обе среды были дополнены сахарозой из расчета 30 г/л и агаром – 6 г/л, рН среды – 5,8. Готовые среды разливались в пробирки и стерилизовались в автоклаве по общепринятой методике [4].

Результаты. На этапе введения в культуру in vitro на обеих средах выявилась инфицирован-ность эксплантов. При первых признаках развития инфекции экспланты извлекались из культуральных сосудов и подвергались повторной поверхностной стерилизации, включавшей короткую промывку в проточной воде, экспозицию в 70 %-м спирте в течение 0,5 минуты с последующим промыванием в стерильной воде в условиях ламинарного бокса. Выполнение этой операции с последующим сильным подрезанием базальной части эксплантов и высадкой в пробирки со свежей средой позволило сохранить некоторую часть растительного материала, имевшего бактериальную зараженность. Для материала с грибным заражением повторная стерилизация была неэффективна. Вследствие инфицированности часть (около 40 %) эксплантов, культивировавшихся на среде WPM, а также все экспланты, культивировавшиеся на среде МС, погибли. С учетом этого обстоятельства все последующие работы с повторно стерилизованным материалом форзиции свисающей выполня- лись только с применением культуральной среды WPM. В дальнейшем наличие инфекций не выявлялось, и последующие пассирования проходили в штатном режиме через каждые четыре недели.

На фоне применявшегося гормонального состава удалось добиться необходимого формирования и элонгации побегов из пазушных почек и (рис.1, а). Полученный растительный материал был расчеренкован на сегменты с одним листовым узлом и с целью пробуждения пазушных почек вновь высажен на питательную среду.

а

Рис. 1. Форзиция свисающая: а – формирование побегов из пазушной почки; б – формирование каллуса в базальной части экспланта

б

Однако со второго пассажа, наряду с ростом побегов из листовых пазух, начался активный рост каллусной массы в зоне нижнего среза микрочеренков (рис.1, б), сопровождавшийся спонтанным укоренением эксплантов (рис.2, а), полностью завершившимся в течение четвертого пассажа.

а                                              б

Рис. 2. Укоренение эксплантов форзиции: а – начало формирования ризоподобных структур; б – растение форзиции с развитыми корнями

Укоренившиеся побеги (рис.2, б) извлекались из питательной среды и после отделения части каллусной массы высаживались в стерильный почвогрунт для адаптации. Адаптация проводилась в условиях повышенной влажности, поддерживаемой с помощью периодических опрыскиваний и содержания растений под полиэтиленовой пленкой. Полив производился по мере необходимости. Проветривание посадок выполнялось один раз в сутки в светлое время в течение 2–3 часов. Процедура адаптации к нестерильным условиям прошла успешно для 80 % растений. Каллусная масса, отделенная от укоренившихся побегов, была пересажена на среду WPM с фитогормонами для дальнейшего роста.

Выводы . Экспериментально установлено, что вегетативный материал форзиции свисающей, взятый из городской среды, при введении в культуру in vitro требует более жесткой процедуры поверхностной стерилизации с применением нескольких стерилизующих агентов. Для инициации ризогенеза у эксплантов форзиции свисающей не требуется применение индукторов корнеобразо-вания, укоренение происходит спонтанно в процессе культивирования. Коэффициент размножения в эксперименте составил 1:3.