Клональное микроразмножение хозяйственно-ценных форм тополя

В настоящее время наряду с традиционными методами воспроизводства древесных растений широко применяют методы биотехнологии, в частности клональное микроразмножение – массовое вегетативное размножение растений в асептических условиях на искусственных питательных средах.

Тополь – одна из быстрорастущих пород, применяющихся в плантационном выращивании для различных целей. Многими зарубежными и отечественными биотехнологами разработаны способы клонального микроразмножения различных видов гибридов и форм тополя: P. Alba L. [1], P. tremula L. [2], P. trichocarpa [3], Р. bal-samifera L. [4], P. Canescens Ait (Sm) [1], Populus x berolinensis Dipp. [5] и др. Особенности культивирования in vitro видов рода Populus подробно освещены в исследованиях [6, 7]. В этих и других работах изучались разные экспланты, способы стерилизации, составы питательных сред, режимы культивирования. Анализ литературных источников по клональному размножению видов рода Populus позволил сделать вывод, что для его разных видов, форм и даже генотипов необходимы специфические условия для индукции регенерации побегов, их доращивания, укоренения и адаптации к почвенным условиям. При работе в культуре тканей in vitro с взрослыми деревьями, прошедшими селекционную оценку, нередко возникают трудности, связанные с низкой регенерационной активностью тканей и высоким уровнем зараженности бактериальной и грибной инфекцией. Исследователи отмечают значительную зависимость морфогенетических реакций от особенностей генотипа, возраста, исходного материала, что требует оптимизации условий культивирования и состава питательных сред для работы с конкретными формами, сортами, гибридами [8, 9].

Исследования базируются на опыте сотрудников лаборатории биотехнологии ВНИИЛГИС-биотех по микроразмножению тополей белого, сереющего и осины [1].

Цель настоящей работы – введение в культуру in vitro отобранных быстрорастущих форм тополя. В задачи исследования входило опреде- ление оптимальных сроков изоляции эксплантов, режимов и способов стерилизации растительного материала для получения асептической жизнеспособной культуры и подбор наиболее эффективных условий инициации, развития и укоренения микропобегов для микрочеренкования.

Объекты и методика

Объектами исследования стали 7 перспективных клонов, гибридов и сортов рода Populus , отличающихся быстрым ростом, зимостойкостью и засухоустойчивостью:

• 1.    Аллотриплоидный гибрид Э.c.-38 (Воронежский гигант). Получен М. М. Вересиным от скрещивания тополя дельтовидного с тополем бальзамическим [10].

• 2.    Регенерата № 78. Естественный евро-американский гибрид черных тополей, отобран А. П. Царевым [11].

• 3.    Болид. Гибрид Белый x Болле, получен в 1976 г. А. П. Царевым [11].

• 4.    Ведуга. Гибрид Белый x Болле, получен в 1976 г. А. П. Царевым [11].

• 5.    Гибрид № 26.10 - Гибрид Белый x Болле, получен в 1976 г. А. П. Царевым [11].

• 6.    Тополь белый № 143 – отобран А. П. Царевым [10].

• 7.    Степная Лада. Гибрид Дельтовидный №14 x Пирамидально-осокоревый Камышинский, получен в 1975 г. А.П. Царевым [11].

Стерилизацию эксплантов проводили в 2 этапа:

• 1)    предобработка 2 %-м раствором коммерческого стерилизующего средства «Domestos» в течение 5–15 мин с последующей промывкой в проточной воде не менее 15 мин;

• 2)    основная стерилизация побегов в условиях ламинар-бокса различными стерилизующими агентами (0,025 %-й раствор мертиолята, 7 %-й и 50 %-й раствор дезинфицирующего средства «Белизна», 70 %-й спирт, 3 %-я перекись водорода) с последующей 3-кратной промывкой стерильной дистиллированной водой.

Культивирование проводили по общепринятой методике при 16-часовом фотопериоде (освещенность 2–3 клк), при температуре 24–26 °С. Пересадку на свежие питательные среды осуществляли каждые 30-35 сут.

Регенерация растений осуществлялась на основе прямой выгонки пазушных побегов, их элонгации и укоренения. Для пролиферации пазушных меристем и элонгации побегов использовались базовые среды MS [12] и WPM [13] с уменьшенным вдвое содержанием макросолей (1/2 MS и 1/2 WPM), дополненные регуляторами роста: 6-бензи-ламинопурин (6-БАП) в концентрации 0,2–1,0 мг/л, гибберелловая кислота (ГК) 0,2 мг/л. Укоренение проводили как на безгормональных питательных средах, так и на средах, дополненных ауксинами: индолил-3-уксусная кислота (ИУК 0,5 мг/л), индолилмасляная кислота (ИМК 0,01 мг/л). Кроме того, использовали среды, дополненные активированным углем (АУ) в концентрации 1 % и с уменьшенной концентрацией сахара (1 %).

Статистическую обработку данных проводили с использованием статистического пакета программ Stadia [14]. Для сравнения выборок использовали t-критерий Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Исследование зависимости выхода асептических жизнеспособных культур от сроков изоля- ции побегов показало, что при использовании летних побегов (май–июнь) выход асептических жизнеспособных культур составил 76,4 %, что достоверно выше (Р < 0,05) результатов по стерилизации зимних (февраль–март) одревесневших побегов (60,6 %) и согласуется с ранее полученными данными для тополей белого и сереющего [1]. Для зимних побегов единственным удовлетворительным режимом стерилизации из проанализированных стал режим 3, другие использованные стерилизующие агенты положительных результатов не дали. При увеличении времени экспозиции более 15 мин значительно повышалась доля нежизнеспособных культур.

Работа с летними побегами требует более мягкой обработки эксплантов и позволяет получить достаточно большую долю асептических жизнеспособных культур при использовании 50 %-го раствора «Белизны» и 70 %-го спирта (таблица).

Наиболее оптимальным способом для летних побегов является предобработка «Domestos» в течение 7 мин и основная стерилизация смесью растворов мертиолята (0,025 %) и «Белизны» (7 %) 10 мин. Этот режим позволяет получить достаточное количество культур для массового ми-кроклонального размножения тополя.

Помимо времени изоляции побегов и способа стерилизации выход асептических жизнеспособных культур зависел также от индивидуальных особенностей деревьев – генотипа и уровня эндогенной инфекции. Для взрослых деревьев

Эффективность стерилизации первичных эксплантов тополя (летние побеги) в зависимости от способа стерилизации на примере тополя Э.с.-38

Режим	Способ стерилизации			Количество культур, %
	Предобработка 2 %-м Domestos (t, мин)	Основной стерилизующий агент	t, мин	асептических жизнеспособных	асептических нежизнеспособных	инфицированных
1	5	«Белизна» (7 %) + мертиолят (0,025 %)	10	54,8±2,9	-	45,2±2,9
2	7	«Белизна» (7 %) + мертиолят (0,025 %)	10	82,8±3,6	3,3±3,3	13,9±7,3
3	10	«Белизна» (7 %) + мертиолят (0,025 %)	10	73,3±3,3	20±5,8	6,7±3,3
4	7	«Белизна» (50 %)	5	68,3±8,8	-	31,7±6,0
5	7	Спирт (70 %)	3	53,3±8,9	-	43,3±12,0
6	7	Перекись водорода (3 %)	5	42,2±6,0	-	57,8±8,9

характерен высокий уровень заражения тканей бактериальной и грибной инфекцией. В опыте использовали 40-летние деревья, для которых доля асептических жизнеспособных культур составила от 64,6 % у гибрида Ведуга до 83,3 % у гибрида № 26.10.

Регенерация растений осуществлялась на основе активации развития уже существующих в растении меристем – выгонки пазушных побегов, что обеспечивает сохранение генотипических особенностей исходных деревьев и обеспечивает получение однородного посадочного материала.

Для инициации развития основного побега испытывали среды с уменьшенным содержанием макросолей – 1/2 MS и 1/2 WPM, как без гормонов, так и дополненные регуляторами роста: 6-БАП (0,2–1 мг/л), ГК (0,2 мг/л).

Результаты исследований показали, что при культивировании на питательной среде 1/2 WPM получена более высокая доля морфогенных культур тополя (до 50 % у тополя № 143) по сравнению с культивированием на среде 1/2 MS (до 26,7 % морфогенных культур у тополя Э.с.-38).

Получены положительные результаты при использовании в качестве индуктора побегообразования БАП в концентрациях 0,2 и 0,5 мг/л. На среде 1/2 WPM без гормонов отдельные побеги удалось получить только для тополей № 143 и Э.с.-38, при этом наблюдалось спонтанное укоренение экспланта. Использование БАП в концентрации 1 мг/л, ГК – 0,2 мг/л отдельно и в сочетании с БАП 0,2 мг/л на этапе выгонки первичного побега приводило к гибели сформировавшихся небольших побегов (0,5–1,0 см) уже на 2-й неделе культивирования.

Эффективность побегообразования зависела от генотипа исходного дерева и гормонального состава среды. Так, наибольшей морфогенетической активностью отличались тополя № 143, Болид, Э.с.-38: эффективность побегообразования составила 80, 60 и 50 % соответственно на среде 1/2 WPM + БАП 0,2 мг/л (рис. 1).

Различия проявлялись не только по частоте, но и по характеру морфогенеза. У всех 7-ми изученных форм в течение 30 сут от начала культивирования на первичных эксплантах развива- лось по одному пазушному побегу размером от 0,5 до 2 см. Однако в целом наблюдался относительно сдержанный рост побегов в высоту. Лучшей ростовой активностью отличались Болид и Степная Лада, на первом месяце культивирования сформировавшие побеги длиной до 1,5–2,0 см, готовые для изоляции и укоренения. У остальных форм максимальная длина побегов достигала 0,9–1,2 см. Такие побеги доращивались (элонгация) в течение 2,0–2,5 мес.

Для элонгации побегов первичные экспланты пересаживали на свежие питательные среды с интервалом 30–35 сут с обновлением нижнего среза стеблевого экспланта на 2–3 мм. Эффективность элонгации зависела от используемых регуляторов роста. Доращивание на средах 1/2 WPM + ГК 0,2 мг/л и 1/2 WPM + БАП 0,2 мг/л + ГК 0,2 мг/л дало результаты только для тополей № 143 и Болид. В остальных случаях культивирование на средах с добавлением ГК способствовало усыханию побегов и гибели эксплантов. Использование БАП в концентрации 0,5 мг/л вызывало появление множества адвентивных побегов, что может привести к сомаклональной изменчивости и нежелательно для получения однородного посадочного материала. Лучшие результаты получены на среде WPM + БАП 0,2 мг/л, что обеспечило прирост побегов до 2 см за один месяц.

Побеги, достигшие 1,5–2,0 см, изолировали и укореняли на питательных средах без гормонов, дополненных ауксинами. Культивирование на без-гормональных средах оказалось эффективным только для тополей Э.с.-38 и № 143, причем луч-

а                 б                  в

Рис. 1. Развитие основного пазушного побега на среде 1/2 WPM + БАП 0,2 мг/л: а – № 143; б – Болид; в – Э.с.-38

шие показатели спонтанного укоренения наблюдались на средах с содержанием сахарозы (10 г/л): 60 % укорененных побегов для Э.с.-38 (как 1/2 WPM , так и 1/2 MS) и до 50 % для тополя № 143 на среде 1/2 MS. Использование активированного угля в концентрации 1 % позволило укоренить 50 % микропобегов тополя Регенерата и 60 % тополя Ведуга. Использование среды 1/2 WPM+ИУК 0,5 мг/л способствовало укоренению 33,3 % микропобегов тополя Э.с.-38 и 20 % микропобегов тополя Степная Лада, для других форм использование ИУК результатов не дало. Лучшие результаты в среднем для всех форм получены при добавлении в среду в качестве индуктора ри-зогенеза ИМК 0,01 мг/л: укореняемость составила от 20 до 71,4 %.

Образование корней начиналось на 7–12 сут культивирования. На 30-е сут длина отдельного корня первого порядка составляла 2,5–6,0 см, число корней достигало 5 на одно растение-регенерант (рис. 2).

Для всех исследуемых форм были получены растения-регенеранты, пригодные для массового клонального микроразмножения.

Выводы

Показана возможность получения асептических и жизнеспособных культур in vitro для 7 хозяйственно-ценных форм тополя: Э.с.-38, Регенерата, Болид, Ведуга, № 26.10, № 143, Степная Лада.

• 1.    Для тополя определены оптимальные сроки изоляции эксплантов (май–июнь) и режи-

• мы стерилизации, позволяющие получить от 64,6 до 83,3 % асептических жизнеспособных культур. Лучшие результаты получены при поэтапной стерилизации 2 %-м «Domestos» в течение 5–7 мин в нестерильных условиях и затем в ламинар-боксе смесью растворов 0,025 %-го мертиолята и 7 %-го дезинфицирующего средства «Белизна».

• 2.    При изучении влияния солевого и гормонального состава питательных сред на формирование и развитие основного пазушного побега выявлено:

• ✓    Наибольшая эффективность побегообразования (31,9 %) достигнута при использовании среды солевого состава 1/2 WPM.

• ✓    Высокой морфогенетической активностью отличались тополя № 143, Болид, Э.с.-38, эффективность побегообразования которых на среде 1/2 WPM + БАП 0,2 мг/л составила 80, 60 и 50 % соответственно.

• 3.    При доращивании индуцированных побегов (размером менее 1 см) эффективным оказалось рекультивирование на среду 1/2 WPM + БАП 0,2 мг/л, что обеспечило прирост побегов до 2 см за месяц.

• 4.    Определены условия укоренения первичных побегов. Спонтанное укоренение наблюдалось у Э.с.-38 (60 % укорененных побегов) и № 143 (до 50 % укорененных побегов) на среде 1/2 MS. Для остальных форм оптимальной является среда 1/2 WPM+ИМК 0,01 мг/л – получено до 71,4 % укорененных микропобегов.

• 5.    Выявлена зависимость всех этапов микроразмножения от генотипа исходного дерева.

  

  а                   б                    в                    г                   д                   е

  Рис. 2. Укореняемость микропобегов на среде 1/2 WPM+ИМК 0,01 мг/л: а – Э.с.-38; б – Болид; в – Ведуга; г – №26.10; д – №143; е – Степная Лада

  
  

Лучшие результаты получены для 2-х форм топо- тополя путем прямой регенерации. Определены ля: Э.с.-38 и № 143.

Заключение

оптимальные сроки изоляции эксплантов, режимы стерилизации, условия культивирования и состав питательных сред на всех этапах получения растений-регенерантов. Полученные микрорастения пригодны для дальнейшего массового

Получены растения-регенеранты 7 перспек- тиражирования с целью получения посадочного тивных для плантационного выращивания форм материала.