Клонирование гена DREB1 и создание его ДНК-маркера, дифференцирующего DREB1 мягкой пшеницы и ее дикорастущих сородичей

Существенные потери в аграрном секторе обусловлены такими абиотическими факторами, как засоленность почв и дефицит влаги. Толерантность растений к этим стрессам носит комплексный характер, то есть

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ в рамках выполнения гранта по Соглашению ¹ 1616-00097 от 27 января 2016 года.

представляет собой результат взаимодействия множества генов и биохимических факторов. Ключевую роль в устойчивости растений играют различные транскрипционные факторы (1, 2). Среди них выделяется группа DREB (dehydration-responsive element binding) из семейства AP2/ERF белков. Транскрипционные факторы DREB в ответ на абиотический стресс индуцируют экспрессию множества генов, связанных с зависимым от абсцизовой кислоты (АБК) и АБК-независимым путем передачи сигнала (35). Транскрипционный фактор DREB специфически связывается с регуляторной последовательностью Dre (5´-TACCGACAT-3´), которую впервые выявили в промоторе гена rd29A (6). Белок DREB содержит щелочной N-концевой аминокислотный регион, действующий как сигнал ядерной локализации. Справа от N-концевого участка расположен ДНК-связываю-щий домен AP2, который состоит из трехцепочечных β -складчатостей и одной α -спирали, почти параллельной β -складчатости (7). Ключевыми для связывания с GCC-боксом ДНК служат семь остатков аминокислот в AP2 домене (8). К ДНК-связывающему домену AP2/ERF прилегает консервативный регион с высоким содержанием серина и треонина (ST-богатый регион), который может служить сайтом фосфорилирования (9). У DREB имеется кислый С-концевой участок, который, как предполагают, обладает транскрипционной активационной активностью (10, 11).

Среди всего разнообразия генов, кодирующих DREB белки, наибольший интерес представляет DREB1 , который связан с устойчивостью растений к различным абиотическим факторам, таким как засуха, засоление, низкие температуры (12-14). Гены DREB1 секвенированы у многих видов растений, в том числе у мягкой пшеницы (15-17). B. Wei с соавт. (17) локализовали гены-гомологи TaDREB1 мягкой пшеницы на хромосомах 3-й гомеологичной группы и выявили полиморфизм по ДНК-последовательностям. Различные однонуклеотидные замены (single nucleotide polymorphisms, SNPs) в DREB1 у пшеницы ассоциированы с устойчивостью к засухе и засолению (18, 19). Кроме мягкой пшеницы, гены DREB были охарактеризованы у родственных ей дикорастущих видов Aegilops tauschii , Leymus chinensis , Elymus spicatus (20-22).

Использование подходов генетической инженерии позволило продемонстрировать роль генов DREB в усилении устойчивости к абиотическому стрессу. В частности, ген дикого ячменя Hordeum spontaneum был встроен в геном Paspalum notatum (23). В этом и других подобных опытах полученные трансгенные растения отличались от контрольных повышенной соле- и засухоустойчивостью (24-27).

Использование генетического потенциала дикорастущих видов, близкородственных пшенице, также может быть полезно для ее генетического улучшения, в том числе повышения устойчивости к биотическим и абиотическим факторам. Эволюционно многие виды формировались в экстремальных эколого-географических условиях (засуха, засоление) (28, 29). Поэтому близородственные неокультуренные сородичи пшеницы могут служить источниками новых генетических вариантов DREB для селекции на устойчивость к стрессам.

В отдаленной гибридизации пшеницы широко используются алло-полиплоидные виды — пырей средний Thinopyrum intermedium (геномная конституция J^rJ^vsSt, 2 n = 6½ = 42) и пырей понтийский Th. ponticum (геномная конституция JJJJ^sJ^s, 2 n = 10x½ = 70) (29, 30). Они несут ценные гены устойчивости к таким факторам, как засоление, засуха и пониженные температуры (31, 32), прорастание на корню (33). Созданы формы пшеницы с генетическим материалом пырея, обладающие устойчивостью 500

к листовой (34-36), стеблевой ржавчине (37), фузариозу (38), вирусу полосатой мозаики (39) и другим заболеваниям. Хромосомы пырея понтийского и пырея среднего относительно легко конъюгируют и обмениваются участками (40). По современным представлениям, донорами субгеномов этих видов служат Dasypyrum villosum (V, 2 n = 2½ = 14), Th. bessarabicum (J^b, 2 n = 2½ = 14) и Pseudoroegneria spicata (St, 2 n = 2x = 14); два первых вида также широко используются в отдаленной гибридизации пшеницы (41-43).

В нашей работе были впервые получены последовательности ДНК генов-ортологов DREB1 у представителей родов Thinopyrum , Dasypyrum , Pseudoroegneria , а также разработан CAPS-маркер P18_ Fok I, которые позволяет различать ген пшеницы TaDREB1 и ген перечисленных видов.

Цель нашего исследования состояла в секвенировании и анализе генов-ортологов DREB1 диких видов, родственных пшенице, и создании ПЦР-маркера, использование которого дало бы возможность различать ген DREB1 диких видов и мягкой пшеницы.

Методика . В работе использовали образцы Thinopyrum bessarabicum (Savul. & Rayss) A. Love (PI 531711), Th. intermedium (Host) Barkworth & D.R. Dewey (PI 401200), Th. ponticum (Podp.) Z.-W. Liu & R.-C. Wang (PI 508561), Pseudoroegneria spicata (Pursh) A. Love (PI 537371), P. stipifolia (Czern. ex Nevski) A. Love (PI 325181), Dasypyrum villosum ( L.) Borbas (W6 21717), семена которых получили из Germplasm Research International Network (GRIN, США), и Th. ponticum (1158A/19), полученный из Главного ботанического сада (ГБС) РАН им. Н.В. Цицина (г. Москва, Россия). Картирование гена DREB1 проводили на наборе линий мягкой пшеницы Chinese Spring, дополненных хромосомами Th. elongatum . Также использовали 10 образцов пшенично-пырейных гибридов (ППГ), содержащих пырейный и пшеничный хроматин, из коллекции ГБС РАН им. Н.В. Цицина — 5542, 2087, 548, 1674, 4082, ЗП26, М3202, 4044, 4015, М12. Контролем служили сорта мягкой пшеницы Triticum aestivum L. Немчиновская 24, Айвина, а также сорта мягкой пшеницы Тулайковская золотистая, Тулайковская 10, Тулайковская 100, Тулайковская 110 с замещенной хромосомой от пырея среднего 6J(6D) (35).

ДНК выделяли из молодых листьев по методу R. Bernatzky с соавт. (44). В ПЦР использовали праймеры P18F (5´-CCC AAC CCA AGT GAT AAT AAT CT-3´), P18R (5´-TTG TGC TCC TCA TGG GTA CTT-3´), P20F (5´-TCG TCC CTC TTC TCG CTC CAT-3´), P20R (5´-GCG GTT GCC CCA TTA GA CAT AG-3´), P21F (5´-CGG AAC CAC TCC CTC CAT CTC-3´), P21R (5´-CGG TTG CCC CAT TAG ACG TAA-3´), P22F (5´-CTG GCA CCT CCA TTG CCG CT-3´), P25F (5´-CTG GCA CCT CCA TTG CTG CC-3´), PRa (5´-AGT ACA TGA ACT CAA CGC ACA GGA CAA C-3´), разработанные B. Wei (17). ПЦР проводили на амплификаторе DNA Engine Tetrad 2 («Bio-Rad», США) по протоколу: 5 мин при 95 ° C (1 цикл); 30-45 с при 95 ° C, 30-60 с при б0 ° C, 40-120 с при 72 ° C (34 цикла); 10 мин при 72 ° C (1 цикл). Образцы хранили при 10 ° C. Продукты ПЦР разделяли в 1,5 % агарозном геле с буфером ТВЕ при напряженности поля 6 В/см.

Для клонирования продуктов амплификации их очищали с помощью набора GeneJET™ PCR Purification Kit («Fermentas», Литва) согласно инструкции производителя. Очищенную ДНК лигировали в вектор pGEM®-T Easy («Promega», США). Вектор трансформировали в Escherichia coli штамм DH10B («Life Technologies», США). Трансформацию проводили на электро-пораторе GenePulser («Bio-Rad», США). Рекомбинантные клоны выявляли методом бело-голубой селекции.

Клоны для секвенирования отбирали с помощью ПЦР с прайме- рами М13, фланкирующими область вставки. Секвенирование осуществляли на приборе ABI-3130XL («Applied Biosystems», США). Выравнивание нуклеотидной и аминокислотной последовательностей выполняли в программе ClustalW2 (45). Для получения гипотетических аминокислотных последовательностей применили ресурс ExPASy (46). Сигнал ядерной локализации находили с помощью алгоритма cNLS Mapper (47). Для определения GCC-связывающих боксов и AP2-связывающго домена воспользовались базой данных Conserved Domain Database (48).

Эндонуклеазу рестрикции (Fok1) подбирали на основании анализа нуклеотидного выравнивания региона, амплифицируемого с праймером P18. Рестрикцию ПЦР-продуктов (10 мкл) проводили в течение 12 ч при 37 ° С, рестрикты разделяли электрофорезом в агарозном 2 % геле.

Результаты. Привлечение генетических ресурсов третичного пула трибы Triticeae играет важную роль в селекционном улучшении пшеницы. В этом отношении перспективны дикорастущие представители родов Thin-opyrum , Dasypyrum , Pseudoroegneria. Они характеризуются соле- и засухоустойчивостью, устойчивостью к вирусным и грибным фитопатогенам, вредителям и другими хозяйственно значимыми признаками (28, 31, 49). Гены DREB1 неокультуренных близкородственных пшенице видов важны в селекции пшеницы на повышенную толерантность к засолению и засухе.

В результате клонирования ПЦР-продуктов, амплифицированных с помощью различных комбинаций праймеров, и их последующего секвенирования мы получили 30 уникальных нуклеотидных последовательностей для шести изучаемых видов дикорастущих злаков: Th. bessarabicum (Thbe1, Thbe2, Thbe3), Th. intermedium (Thin1, Thin2, Thin4, Thin5, Thin6, Thin7), Th. ponticum (Thpo1, Thpo2, Thpo3, Thpo4, Thpo5, Thpo6, Thpo7, Thpo8 — c образца PI 508561; Thpo9, Thpo10, Thpo11, Thpo12, Thpo13, Thpo14, Thpo15, Thpo16 — с образца 1158А/19), P. spicata (Pssp1, Pssp2), P. stipifola (Psst), D. villosum (Davi). Все последовательности были получены с праймерами P18F/R, кроме Thbe1 (P20F + PRa — полноразмерная последовательность гена), Thbe2, Thbe3, Thpo1, Thpo2, Thin1, Pssp1, Davi (P21F + PRa).

Рис. 1. Фрагменты выравненных последовательностей гена-ортолога DREB1 у Thinopyrum bessa- rabicum (строки 1-3), Pseudoroegneria stipifolia (строка 4), P. spicata (строки 5-6), Dasypyrum villosum (строка 7) , Th. intermedium (строки 8-13) , Th. ponticum (строки 14-29) и TaDREB трех субгеномов мягкой пшеницы (три нижние строки). Цветом выделены наиболее крупные инде-лы: четыре индела на участке 299-327 (выделено желтым); регион 682-689 (выделено сиреневым); регион 698-705 (выделено зел¸ным); регион 1266-1268 (выделено голубым); регион 1316-1324 (выделено красным).

Выравнивание последовательностей ДНК с генами DREB1 мягкой пшеницы выявило гомологию (92-98 %) между ними. Основные различия между сиквенсами изучаемых видов и последовательностями мягкой пше- ницы составляли многочисленные SNPs и инсерции/делеции (инделы) (рис. 1). К наиболее крупным относились четыре индела в позициях 299327 у Th. bessarabicum (1 п.н., 6 п.н., 11 п.н. и 3 п.н.) и индел у D. villosum (см. рис. 1, выделено желтым), у всех изучаемых видов — 682-689 (см. рис. 1, выделено сиреневым), 698-705 (выделено зеленым), 1266-1268 (см. рис. 1, выделено голубым) и 1316-1324 (см. рис. 1, выделено красным). Несмотря на значительное количество полученных нами последовательностей ДНК, полиморфизм гена-ортолога DREB1 не ограничивается выявленными SNPs и инделами, поскольку даже внутри одного образца дикорастущего вида может наблюдаться внутрипопуляционное разнообразие.

Полученные ДНК-последовательности были транслированы in silico в гипотетические последовательности аминокислот (АК). Ни одна из них не содержала стоп-кодонов. Все предсказанные АК-последовательности имели одинаковую структурную организацию, характерную для DREB-белка. В N-концевом домене находился сигнал ядерной локализации (NLS). Рядом с AP2 ДНК-связывающим доменом располагалась консервативная ST-богатая область. C-концевой домен был обогащен глутаминовой и аспарагиновой кислотами, что свидетельствует о наличии транскрипционного активационного домена.

Thbe3

Psspl

Pssp2 Davi Thinl

Thin2

Thin4 Thin5

Thin?

Thpo4

Thpo? ThpoS ThpoS Thpo10

Thpo13

ThpolS

Taest_B

I RHR jw

R RjW R

R Rjw R R

R r|w

R R

R R

R R

R R

R R j

R RjW

R RjW R R

R RjW R R W

R RjW R . F

R R jH

R В

R В|»

R R

R RjW

R rIw

R rEw YRGVRqRTW

gkwv; gkwv; gkwv; gkwv; gkwv; gkwv; gkwv; GKWV, gkwv; gkwv; gkwv; GKWV, gkwv; gkwv; gkwv; gkwv, gkwv; GKWV, GKWV, gkwv; gkwv; gkwv; gkwv; GKWV, gkwv; gkwv; gkwv; gkwv; gkwv; GKWV, GKWV, gkwv;

i

iLGlFPTi lgIfpt; lgsfpt;

so

AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSP]

E

8:

s

l:

i

8:

8:

8:

E

F ■

i^lgIfpt; lRlgsfpt; ■lPlgsfpt;

IHLG|FPTj I^LGeEPTi i^lgbfpt; iblgIfpt;

IMLGeFPTj I№LG|FPTj iBlghfpt; wlgIfpt; iBlgIfpt; lRlgsfpti i^lgIppt; lRlgsfpt; тйъсЛррт; iSlgsfpt; iklghfpt;

sli

I * 8 8 I I I я 8

AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSP] aarayddaaramygakarvnfseqs pi lARAYDDAARAM YGAKARVNFSEQS Pi

AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSPl AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSP] AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSP] AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSP]

§

AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSP] AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSP] AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSPl

■aarayddaaramygakarvnfseqs Pl

aarayddaaramygakarvnfseqspi AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSP] AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQS Pl aarayddaaramygakarvnfseqspi AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSP] aARA YDDAARAMYGAKARVl^SEQS P] AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSP) AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSP]

AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSP] AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSPl

|Lg| fptaBaarayddaaram YGAKARVNFSEQS Pl

iJ lgIfpt, i№lgIfpt; TgLGSFPT; iBlgIfpt; mlgIfpt; LgLGSFPT; lRlgsfpt; wlgIfpt; iklgIfpti

AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSP] aarayddaaramygakarvnfseqspi AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSPJ aarayddaaramygakarvnfseqs pi AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSP] aarayddaaramygakarvnfseqspi

AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQS Pl AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSP] AARAYDDAARAMYGAKARVNFSEQSP]

IGKWVAEIREPNBGNRI,wLGsFPTAVBAZlR?lYDCMMMYGaKARVN5SECSPB

Рис. 2. Выравнивание гипотетических аминоксилотных последовательностей AP2 ДНК-связы- вающего домена белка DREB1 Thinopyrum bessarabicum (строки 1-3), Pseudoroegneria stipifolia (строка 4) , P. spicata (строки 5-6) , Dasypyrum villosum (строка 7) , Th. intermedium (строки 813) , Th. ponticum (строки 14-29) и субгеномов A, B и D мягкой пшеницы (три нижние строки) . Стрелками указаны полиморфные аминокислоты в AP2-домене; зеленым цветом выделены аминокислотные остатки, которые взаимодействуют с GCC-боксом, красным — замена по одному такому аминокислотному остатку; звездочками указаны аминокислоты, важные для DRE-специфического связывания.

В функционировании DREB-белка особая роль принадлежит AP2 ДНК-связывающему домену, полиморфизмы внутри этого региона могут оказывать критическое влияние на активность DREB-белка. Во всех гипотетических АК-последовательностях встречался AP2 ДНК-связывающий домен, состоящий из 59 остатков аминокислот (рис. 2). Сравнение АК-последовательностей AP2 ДНК-связывающего домена у изученных образцов показало наличие полиморфизмов по отдельным аминокислотам (single amino acid polymorphism, SAP). Поскольку дикие виды способны занимать различные эколого-географические ниши и проявляют значительное популяционное разнообразие, следует предположить, что SAP-полиморфизм по белку DREB1 может быть шире, чем выявлено нами. В полученных нами последовательностях присутствовали все консервативные аминокислоты AP2-домена в DREB-белков злаков (50), исключение составила последовательность Thpo11: у нее в положениях 25-27 специфичный мотив WLG (25-27) был замещен на RLG (замена триптофана на аргинин) (см. рис. 2). Выявленная нами замена W(R) произошла в одной из семи консервативных аминокислот GCC-связывающего бокса в AP2 домене. Наличие подобной замены в AP2 домене может привести к нарушению пространственной конфигурации белка, что, в свою очередь, скажется на ДНК-связывающей способности (51).

Сравнительный анализ ДНК-последовательностей гена DREB1 шести видов дикорастущих злаков ( Th. intermedium , Th. ponticum , D. villosum , P. spicata , P. stipifolia , Th. bessarabicum ) с ДНК-последовательностями гена DREB1 мягкой пшеницы выявил SNPs, характерные для каждого вида. Это позволило разработать ПЦР-маркер, который может быть использован для идентификации большинства генов DREB1 изученных нами видов в генетическом бэкграунде мягкой пшеницы.

Мы использовали праймеры P18F/R, предложенные B. Wei с соавт. (17), для амплификации консервативной области гена TaDREB1 мягкой пшеницы, кодирующей ДНК-связывающий домен AP2. На основании сравнения нуклеотидных последовательностей генов-ортологов DREB1 , полученных с парой праймеров P18F/R, у пяти изученных видов — Th. intermedium , Th. ponticum , D. villosum , P. spicata , Th. bessarabicum и последовательностей генов DREB1 мягкой пшеницы было выявлено три сайта рестрикции для эндонуклеазы FokI (рис. 3, выделены бирюзовым цветом). Отсутствие одного из сайтов рестрикции и наличие двух других было характерно для большинства последовательностей гена DREB1 у дикорастущих видов, что отличало их от последовательностей гена DREB1 субгеномов A и D мягкой пшеницы. У гена DREB1 субегенома B присутствовал лишь один сайт рестрикции FokI, кроме того, в той же области находилась крупная делеция (более 35 п.н.). Это различие позволило нам создать CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences) маркер P18_FokI, который в большинстве случаев может дифференцировать гены-ортологи DREB1 пшеницы и дикорастущих злаков.

Рис. 3. Фрагменты выравненных последовательностей гена-ортолога DREB1 у Thinopyrum bessa- rabicum (строки 1-3), Pseudoroegneria stipifolia (строка 4), P. spicata (строки 5-6), Dasypyrum villosum (строка 7) , Th. intermedium (строки 8-13) , Th. ponticum (строки 14-29) и TaDREB трех субгеномов мягкой пшеницы (три нижние строки) . Бирюзовым цветом показаны сайты рестрикции для эндонуклеазы FokI.

С помощью разработанного нами маркера P18_FokI была установ- лена хромосомная локализация гена DREB1 в геноме J. Для этого мы использовали серию дополненных линий пшеницы с хромосомами пырея удлиненного Th. elongatum (2n = 2½ = 14, геном JeJe). Контролем служил пырей бессарабский Th. bessarabicum, несущий геном JbJb (2n = 2½ = 14), высокогомологичный геному Th. elongatum. В свою очередь, в коллекциях генетических ресурсов под обозначением Th. elongatum нами были обнаружены только представители полиплоидного вида Th. ponticum (2n = 10½ = 70, геномный состав JJJJJJJsJsJsJs), который ранее называли восточноевропейской разновидностью Th. elongatum (52, 53), что нередко для генетических коллекций видов с затрудненной ботанической идентификацией (54).

Рис. 4. Электрофореграмма, показывающая результаты анализа дополненных линий мягкой пшеницы Chinese Spring c хромосомами Thinopyrum elongatum с помощью CAPS маркера P18_ FokI, ассоциированного с геном DREB1 : 1 — CS + 1J^e, 2 — CS + 2J^e, 3 — CS + 3J^e, 4 — CS + 4J^e, 5 — CS + 5J^e, 6 — CS + 6J^e, 7 — CS + 7J^e, 8 — Triticum aestivum , сорт Айвина, 9 — Th. bessarabicum ; М — маркер длины фрагментов ДНК (GeneRuler 100 bp DNA Ladder, «Thermo Fisher Scientific», США). Стрелкой указан дополнительный фрагмент ~ 600 п.н., амплифицируемый с гена-ортолога DREB1 пырейного происхождения .

Рис. 5. Электрофореграмма, показывающая результаты анализа образцов пшенично-пырейных гибридов и сортов с помощью CAPS маркера P18_FokI для гена DREB1 : 1 — 5542, 2 — 2087, 3 — Тулайковская 110, 4 — Немчиновская 24, 5 — 548, 6 — 1674, 7 — 4082, 8 — ЗП26, 9 — М3202, 10 — Айвина, 11 — Тулайковская 10, 12 — Тулайковская 100, 13 — 4044, 14 — 4015, 15 — Тулайковская золотистая, 16 — М12, 17 — Thinopyrum intermedium , 18 — Th. ponticum , 19 — Pseudoroegneria spicata , 20 — Th. intermedium ; М — маркер длины фрагментов ДНК (Fisher BioReagents™ exACTGene™ DNA Ladders, «Thermo Fisher Scientific», США).

С участием маркера P18_FokI у пшеницы был выявлен фрагмент размером около 570 п.н., у пырея бессарабского — около 600 п.н. (рис. 4, указан стрелкой). У всех дополненных линий мягкой пшеницы c хромосомами пырея удлиненного был обнаружен фрагмент ∼ 570 п.н., специфичный для пшеницы, и только у одной линии CS + 3E, дополненной хромосомой 3Je, — фрагмент ∼ 600 п.н., специфичный для пырея. То есть ген-ортолог DREB1 у Th. elongatum был локализован в гомеологичной 3-й группе, как и у мягкой пшеницы, что подтверждает корректную работу разработанного нами маркера.

Для апробации полученного маркера P18_FokI мы провели последовательно ПЦР и рестрикцию у 10 образцов пшенично-пырейных гибридов. С помощью маркера P18_FokI у всех исследуемых образцов ППГ выявили два фрагмента — размером ∼ 570 п.н. и ∼ 600 п.н., то есть образцы несли DREB1 ген как пшеничного, так и пырейного типа (рис. 5). У всех контрольных образцов мягкой пшеницы, включая сорта мягкой пшеницы с замещенной хромосомой от пырея среднего 6J(6D) — Тулайковская золотистая, Тулайковская 10, Тулайковская 100, Тулайковская 110, фрагмент ∼ 600 п.н. отсутствовал. Следовательно, фрагмент ∼ 600 п.н. пырейного типа специфичен для гена DREB1 , локализованного в 3-й гомеологичной группе.

Маркер-опосредованный отбор способствует повышению результативности селекции. Использование молекулярных маркеров позволяет с наименьшими затратами определить ценные аллели в расщепляющей популяции, быстро и точно идентифицировать любой ген при интрогрессии от линии-донора в геном реципиента, обеспечивает удобный инструмент при бэкроссировании (55). С помощью разработанного нами CAPS-маркера P18_FokI, ассоциированного с геном-ортологом DREB1 , можно увеличить эффективность переноса этого гена из дикорастущих злаков в геном мягкой пшеницы, изучить влияние чужеродного DREB1 гена на устойчивость мягкой пшеницы к засухе, засолению, низким температурам и в перспективе отобрать ценные селекционные формы.

Итак, мы получили ДНК-последовательности генов, ортологичных гену пшеницы DREB1 , у видов Thinopyrum intermedium, Th. ponticum, Th. bes-sarabicum , Dasypyrum villosum , Pseudoroegneria spicata, P. stipifola . Исследование этих нуклеотидных последовательностей выявило полиморфизм между образцами изучаемых видов — наличие однонуклеотидных замен (SNPs) и инделов. Анализ гипотетических аминокислотных последовательностей, кодируемых выявленными генами-ортологами DREB1 , показал консервативность: только в одном сиквенсе обнаружена замена W(R), важная для функционирования AP-2 домена. Создан CAPS-маркер P18_FokI, с помощью которого можно отличать ген-ортолог DREB1 изученных дикорастущих видов от DREB1 мягкой пшеницы. С помощью маркера P18_FokI ген-ортолог DREB1 картирован на хромосоме 3J^e пырея удлиненного. У 10 пшенично-пырейных гибридов обнаружен ген-ортолога DREB1 пырейного происхождения.

Авторы выражают признательность В.И. Белову и В.П. Упелниеку (ГБС РАН им. Н.В. Цицина) за предоставленные образцы пшенично-пырейных гибридов, а также доктору J. Raupp (Kansas State University, США) за образцы линий мягкой пшеницы, дополненных хромосомами Thinopyrum elongatum (созданы Jan Dvorak, UC Davis, США).