Коэкспрессия длинных некодирующих РНК MALAT1, HOTAIR, PVT1 с провоспалительными цитокинами в формировании платинорезистентного фенотипа при раке яичников

Рак яичников (РЯ) входит в первую десятку злокачественных новообразований у женщин по показателям заболеваемости и смертности в мире. При этом 5-летняя выживаемость даже в развитых странах не превышает 46,2 % [1]. Наличие первичной или приобретенной резистентности к платиносодержащей химиотерапии (ХТ) является важной проблемой при эпителиальном РЯ, сужая круг лечебных опций [2].

Длинные некодирующие РНК (днРНК) регулируют множество физиологических и патологических процессов, включая канцерогенез, действуя не только в самой опухолевой клетке, но и в опухолевом микроокружении [3]. Показано, что днРНК влияют на все ключевые признаки рака, в том числе на опухоль-ассоциированное воспаление [4–6].

Очевидно, что воспалительные цитокины широко вовлечены в канцерогенез РЯ [7]. HOX antisense intergenic RNA (HOTAIR) является одной из днРНК, участвующих в воспалительном сигналинге [8], в том числе в опухолевой паренхиме при РЯ [9]. Гиперэкспрессия HOTAIR в ткани РЯ связана с неблагоприятными клиническими характеристиками [10], а также химиорезистентностью опухоли [11]. Metastasis-specific lung adenocarcinoma transcript (MALAT1) способна регулировать экспрессию про-воспалительных цитокинов различными типами клеток [12, 13]. Повышение содержания экзосо-мальной MALAT1 в сыворотке крови коррелирует со снижением общей выживаемости при РЯ [14]; наличие отдаленных метастазов связано с гиперэкспрессией MALAT1 в плазме [15]. Индукция plasmacytoma variant translocation 1 (PVT1) спо- собствует выживанию, росту и миграции опухолевых клеток. Напротив, снижение уровня PVT1 эффективно подавляет метастатическое поведение и распространение опухолевых клеток в клеточных линиях и моделях in vivo [16].

Опухоль-ассоциированное воспаление является неотъемлемым компонентом развития злокачественного процесса – одной из определяющих его характеристик [17]. Клетки паренхимы и стромы солидных опухолей взаимодействуют друг с другом посредством множества воспалительных медиаторов: цитокинов, хемокинов, факторов роста [18]. Связываясь с рецепторами и активируя соответствующий сигналинг, медиаторы изменяют экспрессию генов-регуляторов клеточного цикла, апоптоза и аутофагии, пролиферации, а также провоцируют развитие химиорезистентности [19]. Более того, воспалительное и гипоксичное микроокружение опухолевой клетки снижает уровень ее дифференцировки и придает стволовые свойства, за счет которых клетка становится способной в одиночку воспроизвести всю гистологическую структуру первичного очага и приобретает высокую устойчивость к лекарственному лечению [20].

Использование цитокинов в качестве терапевтических агентов при иммунотерапии, к сожалению, мало влияет на лечение онкологических пациентов вследствие низкой эффективности, небольшого терапевтического окна [21], а также возможности развития тяжелых нежелательных явлений [22]. При канцерогенезе возникает хроническое воспаление с локальным синтезом ряда цитокинов с хемотаксическими, ангиогенными и пролиферативным свойствами. В низких концентрациях, недостаточных для противоопухолевого действия, эти цитокины вызывают усиление роста опухоли [23]. IL-18 (IL-1F4) – один из 7 агонистов семейства IL-1 с провоспалительной активностью [24, 25], которая также обусловлена способностью активировать транскрипционный фактор NF-kB [26], демонстрирующий проопухолевую активность при РЯ [27]. Семейство цитокинов IL-17 синтезируется как лимфоидными, так и нелимфоидными клетками, и их роль в канцерогенезе солидных опухолей неоднозначна и зависит от того, с какими клеточными компонентами иммунитета они взаимодействуют [28]. Показано, что уровень IL-17А в плазме крови может быть маркером и благоприятного, и неблагоприятного прогноза в зависимости от типа опухоли [29].

Цель исследования – оценить коэкспрессию длинных некодирующих РНК HOTAIR, MALAT1, PVT1 с провоспалительными цитокинами в плазме крови как признак возможного формирования платинорезистентного фенотипа рака яичников.

Материал и методы

В исследование включено 46 пациенток с первичным верифицированным эпителиальным

Таблица 1/table 1

Клинические характеристики больных раком яичников, которым выполнялся анализ на свободно циркулирующие lncRna и цитокины в крови

Clinical characteristics of ovarian cancer patients who underwent analysis of circulating lncRna and cytokines in the blood

Показатель/Parameter	Число пациенток/ Number of patients
Возраст – медиана (IQR Q1–Q3), лет/Age – median (IQR Q1–Q3), years – 60,5 (53–67,5)
Уровень СА-125 в крови до лечения – медиана, ЕД/мл/ CA-125 blood level before treatment – median, U/ml –355,5 (259,3–976,3)
Стадия по FIGO/FIGO stage
I	6 (13,0 %)
II	2 (4,3 %)
III	26 (56,5 %)
IV	12 (26,1 %)
Наличие асцита на момент первичной диагностики/ Ascite sat the time of initial diagnosis
Да/Yes	26 (56,5 %)
Нет/No	20 (43,5 %)
Степень дифференцировки/Degree of differentiation
Высокая/High	15 (32,6 %)
Умеренная/Moderate	6 (13,1 %)
Низкая/Low	25 (54,3 %)
Режим химиотерапии/Chemotherapy regimen
Неоадъювантная/Neoad-juvant	31 (67,4 %)
Адъювантная/Adjuvant	15 (32,6 %)
Циторедуктивная операция в ходе первичного лечения/ Cytoreductive surgery during primary treatment
Оптимальная/ Optimal	I–II стадия – 8 (100 %)
	III – 9 (34,6 %)
	IV – 2 (16,7 %)
Неоптимальная/ Suboptimal	I–II стадия – 0 (0 %)
	III – 17 (65,4 %)
	IV – 10 (83,3 %)

33 (73,3 %)

13 (26,7 %)

Выполнена/Completed

Не выполнена/

Not completed

Примечание: таблица составлена авторами.

Note: created by the authors.

раком яичников (табл. 1), проходивших лечение в гинекологическом отделении ГУЗ «Областной клинический онкологический диспансер» г. Ульяновска в 2018–2021 гг. Критерии включения в исследование: возраст не менее 50 лет; отсутствие синхронно развивающихся злокачественных опухолей; отсутствие хронических инфекционных и острых заболеваний; отсутствие хирургических вмешательств в предыдущие 12 мес; гистологически верифицированный эпителиальный РЯ III и IV стадии до начала терапии; добровольное информи-

Таблица 2/table 2

Последовательность праймеров для анализа экспрессии длинных некодирующих РНК Primer sequence for long non-coding Rna expression analysis

днРНК/lncRNA	Последовательность прямого праймера/ Forward primer sequence	Последовательность обратного праймера/ Reverse primer sequence
MALAT1	TTG CCA CTT CTC AAC CGT CC	TCA AAC ACC TCA CAA AAC CCC
HOTAIR	AGT TCC ACA GAC CAA CAC CC	CGT TCC ATT CCA CTG CGA AG
PVT1	TGA CTC TCC TTG TCA TGA GCC	ACT TGA ACG AAG CTC CAT GC
U6 (ген-рефери)/(referee gene)	CTC GCT TCG GCA GCA CA	AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT

Примечание: таблица составлена авторами.

Note: created by the authors.

рованное согласие, соответствующее принципам, изложенным в Хельсинкской декларации (2013 г.). В группу сравнения вошло 12 пациенток с доброкачественными опухолями яичников (ДОЯ), в возрасте от 40 до 60 лет (медиана – 55 лет), не имевших онкологически отягощенного анамнеза.

Образцы плазмы крови были получены после первичной диагностики до начала противоопухолевого лечения. Решение о тактике ведения пациенток (использование полихимиотерапии в адъювантном или неоадъювантном режиме) было принято Консилиумом врачей-онкологов ГУЗ «Клинический онкологический диспансер» на основании Стандартов лечения рака яичников [30].

При анализе клинико-морфологических параметров обследованных пациенток с РЯ учитывались возраст, стадия опухолевого процесса, согласно классификациям AJCCTNM 8-го пересмотра (2018 г.) и FIGO (8-е издание, 2016 г.), степень дифференцировки, наличие асцита на момент постановки диагноза, уровень СА-125 в сыворотке крови до начала лечения (табл. 1).

Пациентки получили стандартное лечение первичной опухоли (6 курсов ХТ по схеме ТР (карбоплатин AUC 6 + паклитаксел 175 мг/м2) и циторедуктивную операцию на I или II этапе лечения). После первичного лечения пациентки динамически наблюдались и были разделены на 2 группы по времени наступления первого рецидива:

– 1-я группа – платинорезистентный РЯ (прогрессирование во время и менее чем через 4 нед после окончания ХТ и ранний рецидив, менее чем через 6 мес после последнего курса ХТ);

– 2-я группа – платиночувствительный РЯ (рецидив более чем через 6 мес), согласно GCIG 4^th Ovarian Cancer Consensus Conference [31].

Прогрессирование наступило у 29 (76,3 %) пациенток с РЯ III–IV стадии.

Из группы сравнения в общую группу пациенток со злокачественными эпителиальными опухолями яичников переместилось 8 человек, имевших по результатам оперативного вмешательства РЯ I и II стадии по FIGO. Показатели экспрессии днРНК HOTAIR, MALAT1, PVT1 в плазме крови пациенток с РЯ I–II стадии не отличались от таковых в группе сравнения (пациентки с ДОЯ).

Образцы плазмы, выделенные из 2 мл ЭДТА венозной крови, хранили при -80 °C до этапа выделения. Для удаления клеточного дебриса кровь центрифугировали дважды – при 600g в течение 20 мин при комнатной температуре и повторно при 6 000g в течение 20 мин при комнатной температуре. Выделение свободно циркулирующих нуклеиновых кислот (НК), в том числе днРНК, проводили с использованием коммерческого набора KIRCN2000 на магнитных частицах SileksMagNA-Direct (ООО “Sileks”, г. Москва, Россия). Процедура выделения включала первоначальный лизис и денатурацию для освобождения НК от комплексов с белками и другими компонентами с использованием лизирующего буфера (20 мин, комнатная температура). В последующем добавляли 5 мкл суспензированных магнитных частиц SileksMagNA-Direct с инкубацией в течение 10 мин при комнатной температуре. Элюция выделенных НК проводилась с использованием специального буфера ElutionSileksMagNA-Direct после инкубации при 80 °C в течение 5 мин. Во избежание возможной деградации растворенной РНК сразу после выделения проводили постановку реакции обратной транскрипции с использованием набора MMLV RT Kit (ООО «Евроген», г. Москва). Затем проводили RT-qPCR с использованием ин-теркалирующего красителя Sybr. Праймеры для анализируемых днРНК были подобраны с использованием программы PrimerBlast на основании нуклеотидной последовательности из базы данных NCBIGenBank. В качестве гена-рефери (housekeeping) для днРНК использован U6 (табл. 2). ПЦР проводилась в триплетах на амплификаторе CFX-96, (BioRad, USA). Расчет ΔСq (нормализованной экспрессии днРНК) проводили с использованием ПО СFXManagerBio-RadLaboratories [32]. Последовательности праймеров приведены в табл. 2. Содержание цитокинов IL-1β, IL-10, IL-17A, IL-18 в сыворотке крови пациенток с РЯ оценивали им-муноферментным методом наборами производства ЗАО ВекторБест (Россия).

Анализ данных осуществляли при помощи прикладного пакета STATISTICA 13.0, Jamovi 2.4.14. Данные в таблицах представлены как медианы с интерквартильным размахом. Уровень статистической значимости оценивали при по-

Таблица 3/table 3

Экспрессия днРНК в плазме крови пациенток с опухолями яичников lncRna expression in the blood plasma of patients with ovarian cancer (Me (Q1–Q3))

Группа/Group	HOTAIR	PVT1	MALAT1
	Относительная экспрессия/Relative expression
Группа сравнения/	0,822	0,948	0,633
Comparison group (n=12)	(0,268–2,814)	(0,463–4,671)	(0,391–0,974)
Платинорезистентный/ Platinum-resistant (n=24) Рак яичников/	2,378 (1,326–3,14) p1=0,039	2,378 (1,169–4,656)	0,752 (0,411–1,202)
Ovarian cancer	2,17		1,710
Платиночувствительный/ Platinum-sensitive (n=22)	(1,169–4,656) p1=0,042	1,284 (1,043–1,926)	(0,713–1,426) p1=0,015