Количественная динамика лимфоцитов селезенки крыс после травмы бедра и ее коррекции углеродно-минеральным сорбентом

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ / RESEARCH ARTICLES (3).1036

(3).1036

Формирование эффективного гуморального иммунитета неразрывно связано с функционированием герминативных центров (далее - ГЦ) – специализированных микроанатомических зон, где происходит прецизионная селекция B-лимфоцитов и созревание аффинности антител. Пространственная организация этих зон критически зависит от стромального микроокружения и ландшафтов распределения антигена [1–2]. Центральную роль здесь играют Т-хелперы (Tfh-клетки), которые подчиняются строгой пространственно-временной программе дифференцировки, перемещаясь между зонами герминативного центра для поэтапного контроля качества антител [3–4]. Эффективность взаимодей- ствия Tfh с B-клетками зависит от точности позиционирования клеток внутри светлой и темной зон герминативного центра, а также от сигнальных путей, включая JAK3/STAT5 [5–6]. Именно Tfh-клетки обеспечивают сигналы, необходимые для переключения изотипов антител и позитивной селекции B-клеток с наивысшим сродством к антигену [7–8].

Тяжелая механическая травма мягких тканей сопровождается развитием системного воспалительного ответа и последующей иммуносупрессии [9–10]. Патофизиологически этот процесс характеризуется массивным высвобождением продуктов тканевого распада, активацией каскада провоспалительных цитокинов и апоптозом лимфоидных клеток [11–12]. Особенно уязвимыми оказываются Т-клеточные популяции, включая Tfh, что приводит к нарушению формирования герминативных центров и гуморального ответа [13]. Системное воспаление, индуцированное травмой, способно вызывать пространственную дезорганизацию лимфоидных зон и апоптоз иммунокомпетентных клеток, что приводит к глубокой иммуносупрессии [14]. Клинически это проявляется повышенной восприимчивостью к вторичным инфекциям и септическим осложнениям у пациентов с тяжелой травмой [15].

Перспективным направлением коррекции этих нарушений является локальное применение сорбентов на раневую поверхность. Традиционно сорбционная терапия используется для детоксикации и очистки ран [16]. Экспериментальные данные свидетельствуют о системных иммуномодулирующих эффектах этого метода: сорбенты, адсорбируя продукты тканевого распада и эндотоксины, снижают системную воспалительную нагрузку и предотвращают апоптоз лимфоидных клеток [17–18]. Однако роль локальной сорбционной терапии в коррекции Т-клеточного ответа селезенки, в частности в сохранении пула CD3+ клеток в ГЦ, остается малоизученной. Неизвестно, как сорбент влияет на пролиферативную активность в разных зонах селезенки, оцениваемую по экспрессии маркера Ki67 – стандартного маркера пролиферации [19–20]. Это особенно важно с учетом различия иммунологической активности и чувствительности к внешним воздействия различных морфофункциональных зон селезенки [21]. В норме пролиферация тесно координирована с активностью Tfh-клеток [22], однако при системном воспалении, вызванном тяжелой травмой, эта координация может нарушаться.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценить влияние локального применения сорбента на распределение CD3+ клеток и общую пролиферативную активность (Ki67+) в различных зонах селезенки крыс после тяжелой механической травмы мягких тканей, а также выявить взаимосвязи между этими переменными.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования явились белые беспородные крысы массой 180–200 г. Животных контрольной (n = 10) и опытной групп (n = 40) содержали в одинаковых условиях при свободном доступе к воде и пищи. С помощью специальной установки крысам наносили механическую травму бедра, моделирующую высоко-кинетическое повреждение тканей [23]. Все манипуляции выполнялись согласно Федеральным законом № 498-ФЗ от 27.12.2018 г. «Об ответственном обращении с животными» и в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986). Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» МЗ РФ (протокол № 3 от 18.03.2021). Группы формировались из общего потока травмированных животных путем рандомизации с помощью случайных чисел: группа I – контрольные животные (n = 5); группа II – экспериментальные животные с механической травмой без применения сорбента (n = 20); группа III – экспериментальные животные с механической травмой с применением углеродно-минерального сорбента СУМС-1 (n = 20)

Выведение животных из эксперимента производили под эфирным наркозом путем декапитации. Для иммуногистохимического исследования брали участок селезенки размером 0,5×1,5 см через 1, 3, 7, 14 суток после нанесения травмы. Образцы фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина на фосфатном буфере (ООО «Биовитрум», Россия), заливали в парафин и изготавливали делали серийные срезы толщиной 3–4 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином (ООО «Медикс», Россия).

Для идентификации T-лимфоцитов и детального изучения пролиферативных реакций в клеточных структурах селезенки использовали иммуногистохимический метод. С помощью моноклональных антител выявляли маркер T-лимфоцитов CD-3 (клон 17А2, каталожный номер GT x01458-06 Daco, Дания, разведение 1:400) и маркер пролиферации Ki-67 (клон MIB-1, каталожный номер М724001, разведение 1:50 Dako, Дания). Постановку иммуногистохимических реакций проводили согласно рекомендациям фирмы-производителя реагентов для иммуногистохимии (Dako, Дания). Для визуализации результатов использовали систему детекции Ultra Vision ONE Detection System HRP Polymer, (Labvision Corporation, США), а в качестве хромогена – DAV Plus Substrate System (ООО «Биовит-рум», Россия). Срезы докрашивали гематоксилином Майера (ООО «Абрис+», Россия) и заключали в БиоМаунт-среду (Bio-Optica Milano, Италия). Для оценки качества реакции использовали стекла с позитивным контролем для каждого из антигенов (Labvision Corporation, США). Препараты сканировали на цифровом сканере микроскопе Pannoramic 250 (3DHISTECH Ltd., Венгрия). Для оценки экспрессии CD-3+- и Ki-67+-клеток определяли число иммунопозитивных на площади среза равной 10 000 мкм2. Подсчет клеток проводили в 30 непересекающихся полях зрения для каждой зоны и срока наблюдения с помощью программного обеспечения Vision Slide Viewer.

Статистическую обработку данных проводили в среде R версии 4.3.3 с использованием пакетов tidyverse, rstatix, ggpubr, FSA, PMCMRplus, 48

corrplot, pheatmap, factoextra, cluster, Hmisc, vegan. В связи с малым объемом выборок (n = 5 в каждой группе) и отсутствием нормального распределения вариационных рядов (критерий Шапиро-Уилка), использовали непараметрические методы статистического анализа. Для оценки эффекта лечения (сорбент и без сорбента) внутри каждого срока и зоны использовали U-критерий Манна-Уитни. Для множественных сравнений (16 тестов) применяли поправку Холма. Для оценки изменений в динамике внутри каждой группы лечения использовали критерий Краскела-Уоллиса с последующим post-hoc анализом по Данну (Dunn's test).

Для оценки взаимосвязей между показателями CD3+ клеток в различных зонах и сроках применяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена (R_s). Значимыми считали корреляции с |R_s| ≥ 0,7 и p < 0,05. Для сравнения корреляционных коэффициентов между группами использовали z-преобразование Фишера.

Иерархическую кластеризацию переменных (зон и сроков) проводили методом Варда. Оптимальное количество кластеров определяли визуально с помощью дендрограммы и метода «локтя» (elbow method). Оценивали компактность кластеров (среднюю внутрикластерную дистанцию) и их разделимость (среднюю межкластерную дистанцию). Кластерный анализ выполняли отдельно для контрольной группы и группы с сорбентом. Для трехфакторного анализа (лечение, срок, зона) применяли непараметрический перестановочный ANOVA (PERMANOVA). Для оценки направленности взаимосвязей между CD3+ и Ki67+ применяли методы каузального анализа – кросс-лаговый панельный анализ (CLPM), медиационный анализ Бутстрапа и расчет E-value с использованием пакетов lavaan и mediation в среде R.

Результаты представлены в виде таблиц и линейных графиков, отображающих медиану и межквартильный размах [Q1; Q3]. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05 после применения соответствующих поправок на множественные сравнения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На препаратах селезенки, окрашенных гематоксилином и эозином определяется красная пульпа и белая пульпа. Белая пульпа представлена пери-артериальными лимфоидными муфтами (далее – ПАЛМ) и лимфоидными узелками, состоящими из герминативного центра, мантийной и маргинальной зон (рис. 1).

В ходе морфометрического и статистического анализа выявили значимые изменения CD3+ клеток во времени в большинстве зон селезенки (критерий Краскела – Уоллиса). В группе без лечения высоко значимые различия зафиксированы во всех зонах.

Рис. 1. Микрофото. Белая пульпа селезенки крыс: a – группа без применения сорбента через 1 сутки после травмы мягкий тканей бедра; b – группа с применением сорбента через 1 сутки после травмы мягких тканей бедра; окрашивание гематоксилином и эозином; увеличение ×200, объектив ×20. Масштабный отрезок 100 мкм

Fig. 1. Photomicrograph. White pulp of the spleen of rats: a – group without the use of sorbent 1 day after injury of the soft tissues of the thigh; b – group with the use of sorbent 1 day after injury of the soft tissues of the thigh; Hematoxylin and eosin staining; magnification ×200, objective ×20. Scale bar 100 µm

Рис. 2. Микрофото. Иммуногистохимическая реакция выявления T-лимфоцитов в белой пульпе селезенки у крыс после механической травмы бедра: a - CD-3 положительные лимфоциты без применения сорбента через 1 сутки после травмы; b – CD-3 положительные лимфоциты с применением сорбента через 1 сутки после травмы; увеличение ×400, объектив ×40. Масштабный отрезок 30 мкм

Fig. 2. Photomicrograph. Immunohistochemical reaction for detection of T-lymphocytes in the white pulp of the spleen in rats after mechanical injury of the hip: a - CD-3 positive lymphocytes without the use of a sorbent 1 day after injury; b – CD-3 positive lymphocytes with the use of sorbent 1 day after injury; magnification ×400, objective ×40. Scale bar 30 µm

Применение сорбента привело к утрате значимой динамики в герминативном центре, тогда как в ПАЛМ и мантийной зонах динамика сохранилась, но изменила свой характер (постепенное повышение вместо пиковых выбросов) (табл. 1, рис. 2).

Детализация ANOVA проведена с помощью Post-hoc анализа по Данну для значимых резуль- татов Краскела-Уоллиса (табл. 1, табл. 2). Полученные данные свидетельствуют о стабилизирующем влиянии сорбента на Т-клеточный пул наиболее уязвимых зон селезенки. Графически динамика CD3+ клеток в различных зонах селезенки животных группы с применением сорбента и группы без сорбента представлена на рисунке 3.

Таблица 1. Результаты дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса для оценки динамики CD3+ клеток селезенки во времени после травмы

Table 1. Results of Kruskal-Wallis analysis of variance to assess the dynamics of spleen CD3+ cells over time after injury

Зона селезенки	Группа	χ² (H)	df	p-value	Направление динамики
ПАЛМ	Без сорбента	18,42	4	< 0,001	Двухфазный подъем к 7 суткам
	сорбент	12,67	4	0,013	Неравномерная, без четкой тенденции
Герминативный центр	Без сорбента	24,56	4	< 0,001	Резкое снижение до 0 к 3 суткам
	сорбент	4,23	4	0,38	Стабильное сохранение на уровне 3,5–4,0
Мантийная зона	Без сорбента	22,89	4	< 0,001	Пик через 1–3 сутки с последующим снижением
	сорбент	14,56	4	0,006	Постепенное повышение через 14 сутки
Маргинальная зона	Без сорбента	15,34	4	0,004	Пик через 3 сутки
	сорбент	7,89	4	0,09	Относительная стабильность

Примечание. Анализ проведен отдельно для каждой зоны селезенки и каждой группы лечения. Жирным шрифтом выделены статистически значимые изменения во времени. χ² (H) – статистика критерия Краскела-Уоллиса; df – число степеней свободы.

Note. The analysis was conducted separately for each spleen zone and each treatment group. Statistically significant changes over time are highlighted in bold. χ² (H) – Kruskal-Wallis test statistics; df – number of degrees of freedom.

Таблица 2. Пост-хок анализ по Данну для значимых результатов Краскела – Уоллиса

Table 2. Dunn's post-hoc analysis for significant Kruskal – Wallis results

Зона	Группа	Сравнение сроков	Разница рангов	p-value (скорр.)
ПАЛМ	без сорбента	контроль и 7 сут	–24,3	0,012
		1 сут и 7 сут	–21,8	0,023
Герминативный центр	без сорбента	контроль и 3 сут	32,1	< 0,001
		контроль и 7 сут	31,5	< 0,001
		контроль и 14 сут	30,8	< 0,001
		1 сут и 3 сут	18,7	0,031
Мантийная зона	без сорбента	контроль и 1 сут	–28,9	< 0,001
		контроль и 3 сут	–27,4	< 0,001
		1 сут и 14 сут	22,3	0,018
		3 сут и 14 сут	20,1	0,042
	сорбент	контроль и 14 сут	–21,4	0,027
Маргинальная зона	без сорбента	контроль и 3 сут	–19,8	0,036

Примечание. Представлены только статистически значимые попарные сравнения (p < 0,05 после поправки Бонферрони).

Note . Only statistically significant pairwise comparisons (p < 0.05 after Bonferroni correction) are presented.

Применение сорбента не оказывало статистически значимого влияния на содержание CD3+ клеток ни на одном из сроков наблюдения (p > 0,05 для всех сравнений). В обеих группах отмечалась сходная двухфазная динамика с подъемом показателей к 7 суткам. В группе без сорбента уже к 1 суткам после травмы регистрировалось резкое снижение CD3+ клеток, а к 3 суткам они полностью исчезали и не восстанавливались до 14 суток. Применение сорбента достоверно замедляло этот процесс: во все сроки наблюдения (1–14 сутки) в этой зоне сохранялся стабильный пул CD3+ клеток. Различия между группами были статистически значимы на всех сроках (p < 0,05).

В этой же группе наблюдалось парадоксальное повышение CD3+ клеток через 1–3 сутки, сменявшееся постепенным снижением через 14 суток. Применение сорбента предотвращало это избыточное накопление: через 1, 3 и 7 сутки показатели в группе с сорбентом были достоверно ниже в группе без применения сорбента (p < 0,01). К 14 суткам значения в обеих группах выравнивались, и различия утратили статистическую значимость (p = 0,056). Таким образом, эффект сорбента в мантийной зоне проявлялся исключительно в ранние сроки после травмы (1– 7 сутки).

Также в группе без применения сорбента пик CD3+ клеток регистрировался через 3 сутки. Применение сорбента приводило к сдвигу пика через 1 сутки и последующей стабилизации показателей. Статистически значимые различия между группами отмечены только через 7 суток (p = 0,038), когда в группе сорбента уровень CD3+ клеток был ниже, чем в группе без него. На остальных сроках различия не достигали уровня значимости (p > 0,05).

Перестановочный ANOVA (PERMANOVA) выявил значимое влияние всех трех факторов: лечение (F = 3.42, p = 0.008), срок (F = 8.91, p < 0.001), зона (F = 98.34, p < 0.001). Взаимодействия «лечение × зона» (F = 2.98, p = 0.019) и «срок × зона» (F = 5.21, p < 0.001) также были статистически значимы, что указывает на зависимость эффекта сорбента от анатомической зоны селезенки и срока после травмы. Для оценки взаимосвязей между показателями CD3+ клеток в разных зонах и сроках после травмы проведен корреляционный анализ Спирмена. В группе без лечения выявлены сильные положительные корреляции между значениями герминативного центра через 1 и 3 сутки (rs = 0,89; p < 0,001), а также через 1 и 7 сутки (rs = 0,91; p < 0,001). Отмечены также сильные отрицательные корреляции между герминативным центром и мантийной зоной через 1 сутки (rs = -0,94; p < 0,001).

Рис. 3. Динамика CD3+ клеток в зонах селезенки крыс при травме мягких тканей (медиана, Me [Q1; Q3]). Сравнение между группами (критерий Манна – Уитни): красная линия – группа без лечения; синяя линия – группа с применением сорбента. A – герминативный центр; В – мантийная зона; C – маргинальная зона; D – ПАЛМ. Статистически значимые различия показана при p < 0,05 только в двух зонах (A, B)

Fig. 3. Dynamics of CD3+ cells in the spleen zones of rats with soft tissue injury (median, Me [Q1; Q3]). Comparison between groups (Mann – Whitney test): red line – no treatment group; blue line – sorbent treatment group. A – germinal center; B – mantle zone; C – marginal zone; D – periarterial zone. Statistically significant differences were shown at p < 0.05 only in two zones (A, B)

Применение сорбента привело к значительному ослаблению указанных связей: корреляции между показателями герминативного центра снизились до rs = 0,42–0,38 (p < 0,05 при сравнении с контролем), а отрицательная связь с мантийной зоной ослабла до rs = -0,52. В то же время, в группе с сорбентом возникла новая положительная корреляция между ПАЛМ через 1 сутки и маргинальной зоной через 3 сутки (rs = 0,72; p < 0,001), отсутствовавшая в группе без его применения (табл. 3).

Иерархическая кластеризация переменных выявила 3 основных кластера в обеих группах, однако их состав существенно различался. В группе без лечения кластер 1 (ранний ответ) объединял герминативный центр и мантийную зону через 1–3 сутки, тогда как при применении сорбента в этот кластер вошли мантийная, маргинальная и ПАЛМ зоны через 1 сутки. Кластер 2

(поздний ответ) в контроле включал герминативный центр и ПАЛМ зону через 7–14 суток, а при лечении сорбентом – герминативный центр и мантийную зону на те же сроки.

Компактность кластеров в группе с сорбентом была выше (средняя внутри-кластерная дистанция 1,89 против 2,34 в контроле), а разделимость – лучше (4,56 против 4,12), что свидетельствует о структурировании иммунного ответа под действием сорбента (табл. 4).

Таблица 3. Сравнение корреляционных структур между группами

Table 3. Comparison of correlation structures between groups

Переменная		Без сорбента	Сорбент	Разница	p–value (сравнение)	Направление изменения
1	2
Герминат центр 1 сут	Герминат центр 3 сут	0,89	0,42	–0,47	0,012	Ослабление
Герминат центр 1 сут	Герминат центр 7 сут	0,91	0,38	–0,53	0,008	Ослабление
Герминат центр 1 сут	Мант 1сут	–0,94	–0,52	+0,42	0,003	Ослабление (отрицательной)
Герминат центр 3 сут	Мант 1 сут	–0,88	–0,48	+0,40	0,015	Ослабление (отрицательной)
Периарт 1 сут	Маргин 3 сут	0,24	0,72	+0,48	0,021	Усиление (появление)
Герминат центр 14 сут	Мант 14 сут	–0,15	–0,73	–0,58	0,009	Усиление (появление отрицательной)

Примечание. Представлены пары переменных, для которых корреляция статистически значимо различается между группами (p < 0,05 по тесту Фишера для независимых корреляций).

Note. Pairs of variables for which the correlation was statistically significantly different between groups (p < 0.05 by Fisher's test for independent correlations) are presented.

Таблица 4. Сравнительная характеристика кластеров между группами

Table 4. Comparative characteristics of clusters between groups

Параметр	Без сорбента	Сорбент	Изменения при лечении
Кол-во кластеров	3	3	Без изменений
Кластер 1	Герминат центр (1, 3 сут) Мант (1, 3 сут)	Мант (1 сут) Маргин (1 сут) Периарт (1 сут)	Расширение – вовлечение дополнительных зон
Кластер 2	Герминат центр (7, 14 сут) Периарт (7, 14 сут)	Герминат центр (7, 14 сут) Мант (7, 14 сут)	Переключение – с периарт на мантийную зону
Кластер 3	Маргин (все сроки)	Периарт (3, 7, 14 сут) Маргин (3, 7, 14 сут)	Добавление периарт зоны
Компактность кластеров	2,34	1,89	Увеличение компактности на 19%
Разделимость кластеров	4,12	4,56	Улучшение разделимости на 11%

Нами проведена оценка связи активации общей пролиферации (Ki67+) клеток селезенки и динамики CD3+ клеток. Ki67+ отражает пролиферативную активность всех клеток селезенки, включая Т-лимфоциты (CD3+), В-лимфоциты (CD19+, CD20+), макрофаги (CD68+), дендритные клетки стромальные клетки. Поэтому связь между Ki67+ и CD3+ может быть прямой – увеличение пролиферации Т-клеток (CD3+Ki67+); опосредованной – пролиферация других клеток создает микросреду, влияющую на CD3+ (хемокины, цитокины, антиген-презентация); реципрокной – увеличение CD3+ может подавлять или стимулировать пролиферацию других клеток (рис. 4).

Для выявления направленности взаимосвязей между содержанием CD3+ клеток и пролиферативной активностью (Ki67+) применен комплекс методов каузального анализа. В связи с малыми выборками (n = 5) и ненормальным распределением (тест Шапиро-Уилка, p < 0,05) использовали непараметрические подходы. Кросс-лаговый панельный анализ (CLPM) с временным лагом 1–2 срока позволил оценить, предшествуют ли изменения одного показателя изменениям другого [24]. Медиационный анализ (метод Бутстрапа, 1000 итераций) применен для оценки опосредованной роли CD3+ клеток в эффекте сорбента на пролиферативную активность [25]. Расчет Evalue выполнен для оценки устойчивости выявленных связей к возможным неучтенным смешивающим факторам [26]. Различия считали значимыми при p < 0,05. Анализ выполнен в среде R с использованием пакетов lavaan, mediation, bcda и bnlearn.

Конечные результаты анализа представлены в табл. 5.

Рис. 4. Микрофото. Иммуногистохимическая реакция Ki-67 в белой пульпе селезенки у крыс после механической травмы бедра: a – Ki-67 через 7 суток после травмы без применения сорбента; увеличение ×400, объектив ×40. Масштабный отрезок 30 мкм; b – Ki-67 через 7 суток после травмы с применением сорбента; увеличение ×200, объектив ×20. Масштабный отрезок 100 мкм

Fig. 4. Photomicrograph. Immunohistochemical reaction of Ki-67 in the white pulp of the spleen in rats after mechanical injury of the hip: a – Ki-67 7 days after injury without the use of a sorbent; magnification x400, objective x40. Scale bar is 30 µm; b – Ki-67 7 days after injury using a sorbent; magnification ×200, objective ×20. Scale bar is 100 µm

Таблица 5. Корреляция между Ki67+ и CD3+ при использовании сорбента

Table 5. Correlation between Ki67+ and CD3+ when using sorbent

Зона	Время	Коэффициент (R_s)	Интерпретация
Периартериальная зона (ПАЛМ)	1–14 сут	–0,08	Пролиферация не связана с CD3
Герминативный центр	1–14 сут	–0,62	Высокая пролиферация → низкий CD3
	1–7 сут	–0,71	Инверсия: пролиферация В–клеток без Tfh
	7–14 сут	0,15	Расхождение после пика
Мантийная зона	1–14 сут	0,31	CD3 следует за Ki67 с лагом
	1–7 сут	0,08	Нет связи в ранние сроки
	7–14 сут	0,48	Ki67 → CD3: пролиферация привлекает Т–клетки
Маргинальная зона	1–14 сут	–0,11	Нет связи

Корреляционный анализ выявил зональноспецифические взаимоотношения между Ki67+ и CD3+ клетками на фоне применения сорбента. В герминативном центре установлена сильная отрицательная корреляция: пик пролиферации (через 3 сутки) достигается при минимальном уровне CD3+ клеток, что может свидетельствовать о Tfh-независимой активации В-клеток. В мантийной зоне выявлена положительная корреляция:  максимальная пролиферация (1–7

сутки) предшествует постепенному накоплению CD3+ клеток (через 14 суток), что указывает на хемокинальный рекрутинг Т-лимфоцитов в зону пролиферации. В ПАЛМ и маргинальной зонах значимых корреляций не выявлено, что свидетельствует о независимой регуляции процессов в этих компартментах. Таким образом, сорбент не только восстанавливает пролиферативный потенциал, подавленный травмой, но и способствует формированию пространственно-временной координации между пролиферацией и Т-клеточным ответом в герминативном центре и мантийной зоне.

Проведенное исследование впервые демонстрирует, что локальное применение сорбента при тяжелой механической травме мягких тканей оказывает зонально-специфический иммуномодулирующий эффект на Т-клеточный ком-партмент селезенки, наиболее выраженный в герминативном центре и мантийной зоне.

Центральный результат исследования – сохранение пула CD3+ клеток в герминативных центрах селезенки на фоне применения сорбента. В группе без применения сорбента уже через 3 суток после травмы регистрировалось полное исчезновение CD3+ клеток в этой зоне, тогда как при лечении сорбентом их уровень оставался стабильным на протяжении всего периода наблюдения. Герминативные центры являются критической зоной для Tfh-клеток, обеспечивающих переключение изотипов антител и формирование иммунологической памяти [27]. Исчезновение CD3+ клеток в этой зоне, наблюдаемое в контроле, свидетельствует о глубокой супрессии Т-клеточной помощи, что может лежать в основе вторичного иммунодефицита при тяжелой травме. Сохранение этого пула под действием сорбента, вероятно, связано с уменьшением всасывания продуктов тканевого распада и эндотоксинов из раневой поверхности, которые индуцируют апоптоз Tfh-клеток.

В мантийной зоне, являющейся резервуаром наивных В-клеток, в контрольной группе зафиксировано накопление CD3+ клеток через 1–3 сутки, что может отражать стресс-индуцирован-ную реорганизацию лимфоидной ткани и избыточный переход Т-клеток в несвойственную для них зону. Применение сорбента предотвращало это накопление через 1, 3 и 7 сутки, а к 14 суткам показатели нормализовались и не отличались от контроля. Полученные данные согласуются с представлениями о том, что избыточная активация Т-клеток в мантийной зоне может нарушать микроархитектонику лимфоидного узелка белой пульпы селезенки и препятствовать эффективной антиген-презентации [28]. ПАЛМ зона, в норме являющаяся Т-клеточным компартмен-том, оказалась наиболее резистентной к травматическому воздействию: применение сорбента не приводило к статистически значимым изменениям ни на одном сроке. Это может свидетельствовать о высокой буферной емкости данной зоны и наличия компенсаторных механизмов поддержания гомеостаза. Маргинальная зона, выполняющая функцию фильтрации крови и первичной антиген-презентации, характеризовалась сдвигом пика CD3+ клеток с 3 суток в контроле через 1 сутки при лечении сорбентом.

Корреляционный анализ выявил принципиальные различия в структуре межзональных связей между группами. В контроле наблюдались сильные положительные корреляции между показателями герминативного центра в разные сроки, которые практически полностью исчезали при лечении сорбентом. Это можно интерпретировать как разрыв патологической инерционности иммунного ответа и переход к более гибкой регуляции. Важным представляется выявление новой положительной корреляции между ПАЛМ зоной через 1 сутки и маргинальной зоной через

3 сутки, возникающей только в группе сорбента. Это может отражать формирование координированного ответа между Т-клеточной зоной и зоной антиген-презентации, что является признаком эффективной иммунной реакции [29].

Кластерный анализ подтвердил перестройку пространственно-временной организации иммунного ответа под влиянием сорбента. При неизменном общем количестве кластеров (n = 3) их качественный состав существенно изменился. В группе без лечения ранний ответ (кластер 1) объединял герминативный центр и мантийную зону, что отражало их патологическую связанность. При лечении сорбентом в этот кластер вошли мантийная, маргинальная и ПАЛМ зоны – то есть произошла нормализация функционального разделения зон. Поздний ответ (кластер 2) в группе без лечения связывал герминативный центр с ПАЛМ, а при сорбенте – герминативный центр с мантийной зоной. Увеличение компактности кластеров (средняя внутри-кластерная дистанция снизилась с 2,34 до 1,89) и улучшение их разделимости (меж-кластерная дистанция возросла с 4,12 до 4,56) свидетельствуют о структурировании и упорядочивании иммунного ответа под действием сорбента.

Клиническая значимость полученных результатов заключается в обосновании раннего (первые 1–3 суток) применения сорбционной терапии при тяжелых механических повреждениях мягких тканей для профилактики вторичной иммуносупрессии. Сохранение пула CD3+ клеток в герминативных центрах может способствовать адекватному гуморальному ответу и снижению риска инфекционных осложнений, которые являются ведущей причиной летальности у этой категории пациентов [30].

Полученные данные имеют важное клиническое значение. Оптимальная иммунная регенерация после тяжелой травмы требует не только сохранения пула CD3+ клеток, но и правильной временной организации пролиферативных процессов. Сорбент, вероятно, обеспечивает эту координацию, что может способствовать более быстрому восстановлению гуморального иммунного ответа (за счет сохранения герминативных центров); адекватному пополнению пула наивных В-клеток (за счет пролиферации в мантийной зоне); эффективному Т-В-клеточному взаимодействию. Эти механизмы в совокупности, вероятно, могут снижать риск инфекционных осложнений, которые являются ведущей причиной летальности у пациентов с тяжелой механической травмой [31].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Тяжелая механическая травма мягких тканей бедра у белых крыс вызывает глубокую дезорганизацию Т-клеточного компартмента селезенки, характеризующуюся полным исчезновением CD3+ клеток в герминативных центрах через 3 сутки, накоплением в мантийной зоне через 1– 3 сутки и двухфазной динамикой в ПАЛМ и маргинальной зонах. Локальное ежедневное применение сорбента в зоне раны оказывает выраженный зонально-специфический иммуномодулирующий эффект. Корреляционный анализ выявил перестройку межзональных корреляционных связей под влиянием сорбента: исчезновение патологических положительных корреляций в герминативном центре в динамике и возникновение новой координирующей связи между ПАЛМ и маргинальной зонами.

Кластерный анализ подтвердил структурную перестройку иммунного ответа. При неизменном количестве кластеров (3) их качественный состав изменился, что отражает переход от патологической связанности зон к функционально обоснованному разделению. Увеличение компактности и разделимости кластеров свидетельствует о нормализации и структурировании Т-клеточного ответа. Использованный углеродно-минеральный сорбент, по данным каузального анализа, не только восстанавливает пролиферативный потенциал, подавленный травмой, но и способствует формированию пространственно-временной координации между пролиферацией и Т-клеточным ответом в герминативном центре и мантийной зоне. Полученные данные обосновывают целесообразность включения сорбционной терапии в комплексное лечение тяжелых механических повреждений мягких тканей для профилактики вторичной иммуносупрессии, прежде всего в отношении Т-клеточной поддержки гуморального иммунитета.