Количественная иммуногистохимическая оценка эффективности радиочастотной денервации лёгочной артерии

(4).928

В последние годы в ряде кардиохирургических клиник в России и за рубежом радиочастотная денервация лёгочной артерии (РЧА ДЛА) выполняется одновременно с открытой хирургической коррекцией приобретенных пороков митрального клапана у пациентов с высокой лёгочной гипертензией. Данная процедура позволяет увеличить эффективность понижения среднего давления в лёгочной артерии, по сравнению с изолированной коррекцией порока митрального клапана, тем самым улучшая отдаленный прогноз для жизни у этой тяжелой категории кардиохирургических больных. РЧА ДЛА показала свою эффективность и безопасность во многих клинических исследованиях [1–3]. Практически всегда РЧА ДЛА проводят с помощью циркулярного воздействия на лёгочной ствол и его основные ветви в области бифуркации.

При РЧА ДЛА происходит термическое повреждение тканевых структур наружной стенки лёгочной артерии, с расположенными на ее поверхности симпатическими волокнами, оказывающими сосудосуживающее влияние на внут-рилёгочные сосуды. Лишь необратимое термическое повреждение указанных симпатических волокон приводит к полной десимпатизации сосудистого русла легких и стойкому снижению давления в лёгочной артерии в послеоперационном периоде.

В одной работе была проведена попытка гистологической оценки эффективности радиоча- стотной абляции лёгочного ствола по данным аутопсийного материала [4]. В этом исследовании для выявления степени термического повреждения стенки лёгочной артерии со стороны адвентициальной оболочки после РЧА-воздействия, использовалась окраска гематоксилином и эозином. Авторы применили разработанную ими полуколичественную оценку повреждения тканей стенки лёгочных сосудов по оценке распространенности участков фибриноидного некроза, метахромазии и разобщенности коллагеновых волокон, а также выделения участков дезорганизации эластических волокон в стенке лёгочных сосудов. Было установлено, что в непосредственной зоне РЧА-воздействия на стенку артерии во всех полях зрения, при прямой микроскопии, выявлялся фибриноидный некроз, что говорило о необратимом термическом повреждении тканей стенки лёгочной артерии в этой области. Чем дальше располагались другие участки стенки сосуда от зоны воздействия, тем больше в полях зрения отмечалось участков лишь метахромазии и разобщенности коллагеновых волокон, что свидетельствовало о меньшем повреждающем воздействии на данный участок стенки сосуда.

Для выявления ретикулярных волокон, периферических нервных волокон и их окончаний, в этой работе применялась также импрегнация солями серебра по методу Сантъяго Рамон-и-Кахаля. Следует отметить, что оценка термического повреждения стенки лёгочной артерии с использованием окраски гематоксилином и эозином лишь опосредованно может указывать на необратимое повреждение нервных волокон вегетативного сплетения, располагающегося, по нашим данным, и данным литературы, преимущественно вдоль боковых стенок лёгочной артерии [3, 5, 6]. По этой причине в последнее время для выявления нервных волокон при изучении иннервации сердца стали использовать иммуногистохимические методы исследования [3, 7].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ : морфологическая оценка эффективности радиочастотной денервации легочной артерии с помощью иммуногистохимического окрашивания ганглионарных нервных сплетений и вегетативных нервных волокон в адвентициальной оболочке лёгочного ствола методом окрашивания их поликлональными антителами к белку S-100 после необратимого термического повреждения вегетативных нервных волокон в результате РЧА- воздействия.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Материалом исследования послужили 30 лёгочных стволов людей, умерших от внесердеч-ной патологии, в возрасте от 31 до 65 лет (секционный материал, полученный при плановых вскрытиях). Между смертью и получением ауто-псийного материала проходило не более 6 ч. Секционный трупный материал лёгочных стволов фиксировали в 10%-м нейтральном забуфе-ренном формалине, в последующем изготавливали парафиновые блоки по стандартной методике. Затем изготавливали парафиновые срезы толщиной 4 мкм на микротоме МПС-2 (Россия). Гистологические срезы наносили на предметные стекла и депарафинировали по стандартному протоколу. После чего проводили иммуногистохимическое окрашивание на иммуностейнере Leica Bond MAX с поликлональным антителом к белку S-100. Патогистологический анализ и фотографирование полученных гистологических препаратов осуществляли с помощью микроскопа Leica DM 4000 с лицензионным пакетом программ для морфометрии Leica Application Suite 3.8. В качестве статистической величины использовали относительную площадь нервных волокон (Soth.) как отношение средней площади окрасившихся нервных волокон в поле зрения к площади всего поля зрения. По каждому лёгочному стволу просмотрено 5 срезов, по 10 полей зрения. Брали среднее значение по изучаемому показателю. Полученный цифровой материал обработан методами дескриптивной и вариационной статистики. Данные представле- ны в виде медианных значений (Me) с указанием ±95%-го доверительного интервала. Различия групп выявляли по методу Манна - Уитни (pm-u). Методы непараметрического анализа использованы в связи с малым числом наблюдений. Различия между группами считали значимыми при p<0,05.

Для РЧА ДЛА был использован экспериментальный РЧА-генератор компании «Ангио Лаб», работающий в диапазоне 440 кГц, имеющий возможность изменения времени воздействия от нескольких секунд до нескольких минут и мощности воздействия от 5 до 120 Вт. Воздействие проводилось при мощности 10 Вт до полного визуального повреждения всей стенки лёгочного ствола в виде появления циркулярной коагуляционной линии в месте РЧА ДЛА.

Пять лёгочных стволов были случайным образом отобраны для изучения топологии вегетативных нервных стволов и служили контролем для сравнения с двадцатью пятью лёгочными стволами, обработанными РЧА ДЛА. Циркулярную РЧА ДЛА осуществляли на специально разработанном стендовом устройстве. Для этого изолированный лёгочной ствол помещали между браншами стендового устройства. Затем верхнюю и нижнюю стенку лёгочного ствола подвергали однократному РЧА ДЛА до полного циркулярного термического повреждения лёгочной артерии в зоне сдавления между бран-шами стендового устройства. После чего, по окружности лёгочного ствола в зоне воздействия, макроскопически определялась зона в виде двух циркулярных линий необратимого термического повреждения стенки сосуда.

Контрольные и обработанные РЧА ДЛА изолированные лёгочные стволы фиксировали в 10%-м нейтральном забуференном формалине, промывали, обезвоживали и заливали в парафин по стандартному протоколу. Оценки эффективности РЧА ДЛА проводили с помощью иммуногистохимического выявления белка S-100 в стенке лёгочной артерии, поскольку ранее нами было выявлено, что обработка лёгочных стволов РЧА ДЛА приводит к полному разрушению нервных волокон с потерей тропности к иммуногистохимическому окрашиванию. Для этого, парафиновые срезы контрольных и обработанных РЧА ДЛА лёгочных стволов толщиной 4 мкм монтировали на предметные стекла и проводили иммуногистохимическое окрашивание на иммуностейнере Leica Bond MAX с поликлональным антителом к белку S-100 по стандартному протоколу окрашивания с докрашиванием клеточных ядер гематоксилином [3].

Патогистологический анализ и фотографирование полученных гистологических препаратов осуществляли с помощью микроскопа Leica DM 4000 с лицензионным пакетом программ для морфометрии Leica Application Suite 3.8.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При неповреждённом нервном стволе вегетативные нервные волокна при иммуногистохимическом окрашивании на белок S-100 интенсивно окрашиваются в оттенки сепии (рис. 1А). Визуализируются как овальные образования, расположенные рядом с vasa vasorum на границе между жировой тканью, окружающей лёгочный ствол, и его стенкой. Клеточные стенки жировых клеток и фибриллярные структуры vasa vasorum и лёгочного ствола окрашиваются в оттенки сепии менее плотно, чем вегетативные нервные стволы. Участки лёгочных стволов, подвергнутые РЧА ДЛА, иммуногистохимически на белок S-100 не окрашиваются (рис. 1Б).

На срезе выявляются базофильно окрашенные клеточные ядра, тени vasa vasorum и рядом расположенных вегетативных нервных стволов. Фибриллярная структура стенок vasa vasorum и лёгочного ствола не просматривается. Вокруг нервных стволов обнаруживаются циркулярные участки расширенного пустого пространства, очевидно образованного парами воды в процессе РЧА ДЛА.

А                                     Б

Рис. 1. Передняя стенка лёгочного ствола. Иммуногистохимическая окраска, ув. ×200.

Примечание: А. 1 – нервное волокно; 2 – vas vasorum; 3 – жировая ткань; 4 – стенка лёгочного ствола; Б. 1 – единичное нервное волокно в структуре vasa vasorum в адвентициальной оболочке лёгочной артерии; 3 – жировая ткань; 4 – стенка легочного ствола

В левом латеральном крае лёгочного ствола (рисунок, а) медианные значения Sотн.=5,72% (95% ДИ 4,27–8,95). В передней и задней стенках лёгочного ствола встречается незначительное количество тонких нервных волокон, Sотн.=0,99% (95% ДИ 0,48–0,93). При вычислении статистических различий между рядами значений Sотн. нервных волокон изучаемых областей лёгочных стволов p<0,0001.

Описанная гистологическая картина соответствует картине термического ожога. Отсутствие характерного иммуногиcтохимического окрашивания белка S-100 объяснимо термической коагуляцией белков в зоне обработки РЧА ДЛА. Очевидно, что белки при этом теряют как свою нативную структуру, так и антигенные свойства в связи с чем окрашивания антителами к маркерному белку не происходит.

В ранее проведённых исследованиях по РЧА-воздействию на адвентициальную оболочку лёгочного ствола в основном применялась окрашивание стенки сосуда гематоксилином и эозином и импрегнация солями серебра по методу Сантъяго Рамон-и-Кахаля для выявления ретикулярных волокон, периферических нервных волокон и их окончаний [8]. Следует отметить, что оценка термического повреждения стенки лёгочной артерии с использованием окраски гематоксилином и эозином лишь опосредованно может указывать на необратимое повреждение нервных волокон вегетативного сплетения, располагающегося, по нашим данным, и данным литературы, преимущественно вдоль боковых стенок лёгочной артерии.

Стереотип мышления при морфологической оценке состояния органов на тканевом и клеточном уровне проявляет себя использованием веками апробированных гистологических методов исследования, не предназначенных для объективной оценки современных методов воздействия на биологические объекты. К таковым, в частности, относится метод РЧА нервных волокон лёгочного ствола, позволяющий эффективно и на долгий срок снизить до безопасного уровня давление в лёгочной артерии у больных с клапанной патологией миокарда [1-3]. Тем не менее, и в эксперименте, и в реальной клинической практике эффективность и безопасность РЧА зависит от методической организации её проведения: непрерывная, импульсная, мощность, длительность и глубина воздействия и т.д. [3, 4]. Поскольку в клинической практике in vivo эффективность режимов РЧА может быть оценена только по конечному результату, то подбор качественно-количественных характеристик перечисленных выше параметров осуществляется на экспериментальном этапе, для чего требуется объективная морфологическая оценка. Тем не менее, в качестве таковой используется окрашивание гематоксилином и эозином, метод, не предназначенный для выявления нервных волокон, с помощью которого можно дать только общеморфологическую оценку теплового повреждения глубоких слоёв лёгочного ствола, но не оценить жизнеспособность нервных волокон. Импрегнация солями серебра по методу Сантъяго Рамон-и-Кахаля в силу своих тинкториальных особенностей также не позволяет провести оценку жизнеспособности нервных волокон, поскольку поверхность нервных волокон серебром импрегнируется в независимости от того подвергся ли ствол коагуляции или нет. И только после длительного периода жизни, когда нервный ствол полностью разрушился, импрегнация серебром выявит его 42

отсутствие. Это невозможно реализовать в экспериментах на аутопсийном материале, как единственно доступном при изучении эффективности и безопасности РЧА на материале человека, имеющего отличительные особенности иннервации лёгочного ствола от животных [3, 9-16]. Иммуногистохимическое выявление нервных волокон и ганглиев с использованием антител к белку S100, а также селективная иммуногистохимическая визуализация симпатических нервов по антителам к тирозингидроксила-зе, парасимпатических нервных волокон по антителам к ацетилхолиновому M1 рецептору, антителам к D5 дофаминовому рецептору для оценки эффективности эндоваскулярной катетерной денервации лёгочной артерии описана в 2021 г. [3].

Однако авторы этого исследования для оценки эффективности проведённой РЧА использовали полуколичественную оценку иммуногистохимического окрашивания. Тогда как нами использована оценка прямого количественного анализа относительной площади окрасившихся нервных стволов. Использованный нами метод количественного морфометрического анализа позволяет избежать субъективизма при оценке степени повреждения. Кроме того, использование в качестве статистической величины параметра Sотн. позволяет уменьшить морфометрические ошибки измерения размеров гистологических объектов в исследуемых срезах, связанные с изменениями ткани в процессе фиксации и заливки в парафин.

В представленном экспериментальном исследовании мы показали возможность специфической оценки повреждения вегетативных нервных волокон в адвентициальной оболочке лёгочного ствола методом их окрашивания на Иммуностейнере Leica Bond MAX с поликлональным антителом к белку S-100 после РЧА-воздействия.

Таким образом, иммуногиcтохимическое окрашивание поликлональным антителом к белку S-100 является состоятельным методом верификации необратимого термического повреждения вегетативных нервных волокон в стенке лёгочной артерии в результате проведения РЧА ДЛА. Данный способ гистологического окрашивания может быть использован в клинической и экспериментальной работе для оценки эффективности проведённой абляции как на аутопсийном, так и биопсийном материале.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предложенная методика количественной иммуногистохимической оценки факта необратимого термического повреждения нервных стволов в области бифуркации лёгочной артерии в результате РЧА-воздействия позволяет провести более объективную оценку эффективности этого хирургического вмешательства, по сравнению с ранее предложенными методиками оценки. Данный способ гистологического окрашивания может быть использован в клинической и экспериментальной работе для оценки эффективности проведённой абляции как на аутопсийном, так и биопсийном материале.