Количественная нагрузка вируса папилломы человека 16 типа и прогнозирование эффективности лечения рака шейки матки

В настоящее время этиологическая роль вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска (ВКР) в канцерогенезе рака шейки матки (РШМ) убедительно доказана. В ряде работ показано, что персистенция вируса с высокой нагрузкой может способствовать быстрой прогрессии цитологически нормальных клеток шейки матки в диспластически измененные и далее – в опухолевые [2, 4, 8, 9, 14, 16]. Роль количественной нагрузки ВПЧ ВКР в прогнозе течения уже состоявшегося РШМ до сих пор окончательно не определена. По данным одних авторов, чем выше вирусная нагрузка, тем лучше клинический исход заболевания [5, 13]. По другим данным, вирусная нагрузка не имеет никакого значения для прогноза, значимой является только экспрессия вируса [3]. Задачей настоящего исследования явилось изучение возможной связи между количеством копий ДНК ВПЧ 16 и экспрессией вирусного онкогена Е7 у больных РШМ и значения вирусной нагрузки для прогноза данного заболевания.

Материалы и методы

Исследуемую группу составили 64 больные с гистологически верифицированным первичным ВПЧ 16-положительным раком шейки матки. Степень распространенности опухолевого процесса оценивали в ходе комплексного обследования с использованием ультразвукового метода исследования (УЗИ) с допплеровским картированием, компьютерной томографии (КТ) и магнитно-резонансной томографии (МРТ). Основным методом лечения являлась сочетанная лучевая терапия. У больных с местно-распространенными формами заболевания проводилось химиолучевое лечение, которое предусматривало проведение сочетанной лучевой терапии на

Киселева В . И .* – в . н . с ., к . б . н .; Крикунова Л . И . – зав . отделением , д . м . н ., проф .; Любина Л . В . – в . н . с ., к . м . н .; Мкртчян Л . С . – с . н . с ., к . м . н .; Безяева Г . П . – н . с .; Панарина Л . В . – н . с .; Скугарев С . А . – врач - онколог ; Саенко А . С . – зам . директора по научн . работе , д . м . н ., проф . ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России . Куевда Д . А . – зам . заведующего отд . по научн . работе ; Трофимова О . В . – научн . сотр . ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора России .

• * Контакты : 249036, Калужская обл ., Обнинск , ул . Королева , 4. Тел .: (48439) 9-72-77; e-mail: vaivki@mrrc.obninsk.ru .

фоне 3-х циклов нормодозной полихимиотерапии препаратами платины и фторурацила. Эффективность терапии оценивали по степени регрессии опухоли спустя 3 месяца после окончания курса лечения.

Наличие ДНК ВПЧ исследовали до начала лечения в соскобах эпителиальных клеток из цервикального канала и наружной поверхности шейки матки (ШМ), а также в соответствующих биоптатах опухоли. Выделение ДНК проводили сорбентным методом с применением наборов «ДНК-сорб В» – для соскобов и «ДНК-сорб С» – для биоптатов (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора России – ФГУН ЦНИИЭ). Анализ количественной нагрузки, физического статуса ДНК ВПЧ 16 и экспрессии вирусного онкогена Е7 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на «iCycler iQ» («BioRad», Германия) и «Rotor Gene» («Corbett Research», Австралия). В одной пробирке амплифицировали участки генов Е2 и Е7 вируса и гена β-глобина. Степень интеграции оценивали по соотношению количества Е7/Е2 (Е7 интегрируется, Е2 не интегрируется в геном) с помощью разработанного нами алгоритма с учетом стандартного отклонения и коэффициента вариации. Вирусную нагрузку определяли по количеству копий Е7 гена на 105 клеток. Уровень экспрессии вирусного онкогена Е7 оценивали по количеству мРНК транскриптов после обработки образцов ДНК-азой, с учетом остаточной ДНК, не подвергшейся деградации. В качестве контроля сохранности РНК одновременно проводили амплификацию участков мРНК гена домашнего хозяйства GapdH. Полученные значения РНК ВПЧ 16 нормализовали на 105 клеток.

Статистический анализ результатов проводили в соответствии с критериями Фишера и Спирмана.

Результаты и обсуждение

Из 64 больных интегрированная форма ДНК ВПЧ 16 обнаружена у 21 пациентки (31,8 %), из них в 10 случаях обнаружена 100 % интеграция и в 11 – частичная. У 45 пациенток (68,2 %) ДНК ВПЧ 16 выявлена в эписомальной форме. Эта группа объединяет больных как с чисто эпи-сомальной ДНК вируса, так и с очень низкой степенью ее интеграции, которая находится за пределами чувствительности метода оценки физического статуса ВПЧ. По клинико-морфологическим характеристикам опухоли с интегрированной и эписомальной ДНК ВПЧ распределяются примерно в одинаковых пропорциях (таблица 1).

Таблица 1 Клинико - морфологические характеристики опухолей

Исследуемые опухоли по критерию вирусной нагрузки распределились следующим образом: высокая (количество копий ДНК ВПЧ на 100 тыс. клеток равно или выше 5 lg) - 39 случаев, низкая - (lg копий ДНК ВПЧ/100 тыс. клеток < 5) - 25 случаев. Информация о состоянии больных спустя 2 и 3 года после курса терапии получена в 61 и 50 % случаев соответственно. Анализ отдаленных результатов показал выраженную тенденцию более высокой частоты рецидивов заболевания и смертности в группе с условно низким содержанием вируса (таблица 2). Когда аналогичный анализ провели раздельно по группам с интегрированной ДНК вируса (степень интеграции от 25 до 100 %) и эписомальной, оказалось, что в 1-ой группе частота безрецидив-ной выживаемости больных обратно коррелирует с вирусной нагрузкой (р=0,03 и р=0,05 спустя 2 и 3 года после лечения) и со степенью интеграции вируса в клетку (р=0,09 и р=0,02 соответственно). Кроме того, в этой группе выявлена четкая обратная корреляция вирусной нагрузки со степенью интеграции ДНК вируса (R=-0,73; p=0,001; n=16), прямая корреляция степени интеграции ДНК с экспрессией вирусного гена Е7 (R=0,7; р=0,02; n=9) и тенденция обратной корреляции вирусной нагрузки с экспрессией гена Е7 (R=-0,6; p=0,07; n=10). Т.е., чем выше степень интеграции вируса, тем ниже его количественная нагрузка и тем выше экспрессия вирусного онкогена Е7 и хуже прогноз РШМ. Важно отметить, что выявленные корреляции не зависят от морфологических характеристик и стадий опухолей. В группе с эписомальной ДНК ВПЧ 16 не наблюдалось ни прямой, ни обратной корреляции вирусной нагрузки ни с экспрессией Е7 (R=-0,36, p=0,34, n=9), ни с выживаемостью больных.

Таблица 2

Сравнение отдаленных результатов лечения больных РШМ с ВПЧ 16 в зависимости от количественной нагрузки и физического статуса вируса

Таким образом, в соответствии с полученными результатами можно полагать, что ответ РШМ на противоопухолевую терапию, по-видимому, непосредственно не связан с количественной нагрузкой ВПЧ 16, на исход заболевания, скорее всего, влияет физический статус вируса.

Известно, что высокая степень интеграции обусловливает повышенную стабильность вирусных транскриптов [6], усиливает экспрессию вирусных онкогенов Е6/Е7 [13] и может служить фактором плохого прогноза эффективности лечения РШМ [7, 10-12, 15]. Причиной выявленной статистически значимой обратной корреляции выживаемости больных с вирусной нагрузкой в группе с интегрированной ДНК ВПЧ, возможно, является утрата вирусом способности к репродукции в процессе интеграции его в клетку [1]. Тем не менее, выявленные корреляции позволяют считать, что вирусная нагрузка в опухолях с интегрированной ДНК ВПЧ 16 может косвенным образом отражать тяжесть прогноза заболевания.

Обнаруженные в литературе противоречивые сведения относительно роли количественной нагрузки ВПЧ ВКР в прогнозе эффективности противоопухолевой терапии и исхода заболевания РШМ, возможно, связаны с тем, что, как правило, анализ проводился в группах, объединяющих опухоли, ассоциированные и с эписомальной, и с интегрированной формой вируса. В этом случае результаты могут зависеть от того, какую долю в группе составляют опухоли с интегрированной ДНК ВПЧ.

Настоящее исследование поддержано Министерством образования и науки Российской Федерации в рамках Государственного контракта № 16.512.11.2096 «Разработка метода диагностики гиперпролиферативных заболеваний органов женской репродуктивной системы на основе интеграции молекулярно-генетических и клинико-радиологических методов».