Количественное определение валериановой кислоты в корнях ферула сумбул с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии

Род Ferula (Umbelliferae) включает 130 видов, распространенных от Средиземноморья до Средней Азии. Этот род хорошо задокументирован как хороший источник биологически активных соединений, таких как кумарины, терпеновые спирты и производные сесквитерпена [1]. Ферула сумбул (син. F. moschata Reinsch.), широко известный как сумбул (хинди) или мускусный корень (англ.), состоит из цилиндрических или конических кусочков высушенных корней и корневищ с горьким вкусом и легким мускусным запахом [2]. Он традиционно использовался для снятия беспокойства, как успокаивающее средство при истерии и других нервных расстройствах, а также как мягкий стимулятор желудочно-кишечного тракта. Кумарины и бикумарины, выделенные из этанольного экстракта корней Ferula sumbul, проявляют анти-ВИЧ-активность и ингибируют высвобождение цитокинов [3].

Настоящее исследование включает оценку содержания валериановой кислоты в корнях Ферула сумбул с использованием ультраэффективной жидкостной хроматографии (UPLC). ВК является одним из важных компонентов препарата валериана лекарственная [4,5] и в основном отвечает за его анксиолитическую активность. Экстракт его корня веками использовался для лечения тревоги, эпилепсии и нарушений сна. UPLC, производная от хорошо известного аналитического метода, работает по тому же основному принципу, что и высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC), но уменьшенный размер частиц в колонке обеспечивает повышенную чувствительность, лучшее разрешение и более короткое время работы [6,7]. Уже зарекомендовавший себя метод ВЭЖХ для оценки ВА включает сложную систему растворителей для ее количественного определения [8,9]. Описанный здесь метод ВЭЖХ имеет более короткое время выполнения, потребляет меньше растворителя ВЭЖХ и эталонного стандарта и обеспечивает лучшее разделение и повышенное разрешение.

Корни ферулы сумбул были закуплены у Rym Exports, Мумбаи, Индия. Они были заверены NISCAIR, Нью-Дели, с номером образца ваучера NISCAIR/RHMD/Consult/2014/2483-62-2 от 18.07.2014. Эталонный стандарт ВА был приобретен у Sigma-Aldrich, метанол для ВЭЖХ был получен у Merck Specialties Pvt. Ltd. (Мумбаи, Индия) и воду класса ВЭЖХ получали из системы Millipore (Биллерика, Массачусетс, США).

Точную навеску 1 мг ВК растворяли в метаноле и доводили объем до 10 мл в мерной колбе, получая концентрацию 100 мкг/мл. Его использовали в качестве маточного раствора для дальнейших разбавлений. Грубо измельченные корни Ферула сумбул (2 г) кипятили с обратным холодильником в течение 30 мин с метанолом для ВЭЖХ (20 мл). Полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр Whatmann (№ 10). Остаток промывают метанолом (5 мл), переносят в мерную колбу на 25 мл и доводят объем до концентрации 80 мг/мл. Его фильтровали через шприцевой фильтр 0,22 мкм. Раствор образца (0,50 мкл) вводили в систему ВЭЖХ. Весь процесс проводился в трехкратной повторности.

Анализ проводился на системе Waters Acquity UPLC H-Class, оснащенной бинарным насосом, автоматическим пробоотборником, матричным фотодиодным детектором (PDA) и программным обеспечением Empower 2™ (Waters, Милфорд, Массачусетс, США). Аналитический метод был разработан с использованием колонки BEH Acquity RP, C-18 (2,1×50 мм, 1,7 мкм, Waters, Милфорд, Массачусетс, США). Подвижная фаза состояла из метанола (растворитель А) и 0,5% фосфорной кислоты (растворитель Б) в соотношении 75:25. Скорость потока устанавливали на 0,25 мл/мин, вводимый объем составлял 0,50 мкл, температуру колонки поддерживали на уровне 25° с помощью термостата для колонок, детекцию проводили с помощью детектора PDA при 218 нм.

Разработанный метод ВЭЖХ прошел валидацию в соответствии с рекомендациями ICH (Q2 (R1)) с точки зрения линейности, чувствительности, прецизионности, достоверности и надежности исследования [10]. Линейность определяли, используя уровни концентрации, построенные в диапазоне 0,5-2,0 мкг/мл. Калибровочную кривую строили путем построения площади пика в зависимости от концентрации. Коэффициент регрессии, наклон и точка пересечения рассчитывались по калибровочной кривой. Чувствительность метода определяли по пределу обнаружения (LOD, S/N=3) и пределу количественного определения (LOQ, S/N=10). Были введены серийные разведения стандартного раствора, и, таким образом, значения LOD и LOQ были рассчитаны с помощью программного обеспечения пригодности системы UPLC. Повторяемость метода анализировали путем введения разовой концентрации ВА шесть раз (n=6) в течение одних суток. Данные прецизионности выражали в процентах относительного стандартного отклонения (%RSD). Для определения точности метода проводили исследование извлечения путем добавления известного количества индивидуального стандарта при низке (80%), средней (100%) и высокой (120%) концентрации в крупноизмельченный лекарственный препарат и готовили образец. как описано ранее. Полученные таким образом три концентрации анализировали в трех повторностях, и результаты выражали в виде процентного извлечения добавленного стандарта. Надежность метода определяли путем преднамеренного изменения условий хроматографии, таких как изменение скорости потока (0,25±0,02 мл/мин), состава подвижной фазы (75:25±5) и объема впрыска (0,5±0,1 мкл). Каждый параметр анализировали трижды, и изменения времени удерживания выражали в %RSD по отношению к нормальному времени удерживания.

Оптимальные хроматографические условия были получены на колонке Acquity BEH Acquity, RP C-18 и изократическом элюировании с использованием различных соотношений метанол:0,5% водная фосфорная кислота (75:25) в качестве подвижной фазы для разработки метода ВА методом ВЭЖХ. Оптимизированные хроматографические условия привели к хорошо отделенному пику ВА в метанольном экстракте корней Ферула сумбул со стабильной базовой линией.

Валидацию разработанного метода проводили путем построения стандартной кривой ВА. Для стандарта ВА коэффициент корреляции (r2) оказался равным ≥0,998, что указывает на высокую степень корреляции между выбранными концентрациями и соответствующими площадями пиков, а также указывает на хорошую линейность разработанного метода. Наклон, точка пересечения и коэффициент корреляции для стандарта были определены с помощью регрессионного анализа. LOD для ВА составил 30 нг/мл, а LOQ – 100 нг/мл, что указывает на достаточную чувствительность метода. Было обнаружено, что значения %RSD для исследований повторяемости составляют 0,506%, что соответствует допустимым пределам (≤5) в соответствии с рекомендациями ICH. Было обнаружено, что процент восстановления для стандарта ВА находится в диапазоне 99,44102,02 с %RSD≤1,311, что свидетельствует о хорошем восстановлении стандарта. Значения %RSD для всех преднамеренно внесенных изменений в условия ВЭЖХ оказались в допустимых пределах: для расхода 0,0380,311; для состава подвижной фазы 0,035-0,605; для объема впрыска 0,1610,395. Для различных учитываемых параметров значения %RSD были менее 5%, что ясно указывает на надежность аналитического метода.

Цель настоящего исследования заключалась в разработке быстрого, точного и надежного аналитического метода для оценки ВА. ВА считается основным компонентом, ответственным за деятельность центральной нервной системы, и официально зарегистрирован как маркерное соединение

[11,12]. Основная цель исследования заключалась в описании метода ВЭЖХ, который можно было бы использовать для количественного определения и стандартизации корней Ферула сумбул. Предлагаемый метод имеет короткое время выполнения 7 мин, с временем удерживания около 3,2 мин. При таком коротком времени анализа и хорошем разрешении этот метод предлагает существенные преимущества по сравнению с ранее описанными методами ВЭЖХ [8] и, следовательно, может быть расширен для аналитических целей.