Количественные изменения продуктов перекисного окисления липидов в условиях стресса

Известно, что любые изменения окружающей среды в организме вызывают стресс-реакцию. Последнее выражается изменением клеточного метаболизма, активности генетического аппарата и т.д. (Левицкий Е., 1998,). При кратковременном действии стресс-факторов происходит усиление функционирования клеток и мобилизация организма в целом. Однако, при продлении стресс-реакции, организм отвечает на стресс-факторы необратимыми процессами, которые ведут к гибели клетки. К таким процессам относятся свободно-радикальное окисление, изменение количества внутриклеточного Са2+, угнетение энергетического метаболизма, снижение синтеза белков и др. (Zhuravliova E. et al., 2009,Салей А.П., Рецкий М.И. 2003, Cernak et al., 2000).

Одним из основных изменении клеточного метоболизма является активация перекисного окисления липидов (ПОЛ). В нормальных условиях количество продуктов ПОЛ в тканях держится на определенном уровне, так как они необходимы для нормального функционирования организма. Они способствуют уничтожению разрушенных компонентов дыхательной цепи в митохондриях, активируют процессы пролиферации и дифференциации клеток, транспорт ионов, участвуют в регуляции проницаемости клеточных мембран, разрушении поврежденных хромосом и т.д. ПОЛ в клетке осуществляется активной формой кислорода. Постоянный уровень продуктов ПОЛ поддерживается с помощью антиоксидантной системы клетки.

В нормальных условиях молекулярный кислород является компонентом реакции образования молекул воды. Катализатором реакции является цитохромоксидаза, которая способствует присоединению к молекуле кислорода четырех электронов. В процессе функционирования клетки О 2 может присоединять один электрон, вследствие чего образуется супероксид-анионный радикал (О 2 ^- ). Последний, взаимодействуя с разными молекулами, индуцирует в мембранах и липопротеинах сыворотки крови ПОЛ (Radi et al., 1991). Также, одним из активированных форм О 2 является оксид азота - NO. NO способен проходить через клеточные мембраны и взаимодействуя с супероксид-радикалом, превращается в пероксиднитрит - (ONOOH^-), который обладает высокой реакционной способностью, разрушает клеточные структуры и вызывает смерть клеток. В кислой среде пероксиднитрит способствует высвобождению гидроксид-радикала, окисляет сульфгидрильные группы белков и участвует в нитрировании тирозиновых радикалов белков, что сопровождается изменением их свойств. Процесс разрушения клеток продолжается до включения клеточной антиоксидантной системы. ПОЛ вызывает нарушение упаковки мембранных слоев и возможное последующее нарушение целостности клеточной мембраны, что сопровождается различными патологическими процессами. В частности, воспалением, нейродегенеративными заболеваниями и т.д.

Целью представленной работы является установление взаимосвязи между изменением количества NO, общих липидов и ПОЛ в условиях воздействия таких факторов эмоционального стресса, как изоляция животных и нарушение циркадного цикла.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводились на половозрелых белых лабораторных крысах, которые подвергались социальной изоляции (в индивидуальных клетках) в условиях темноты (соотношение темнота/свет 23,5/0,5 час) в течение 10-, 20- и 30 дней. Контрольная группа находилась в естественных условиях (темнота/свет 10,00/14,00 час). После эксперимента животные декапитировались. Митохондриальные и цитозольные фракции получали методом дифференциального центрифугирования (De Robertis, 1969).

Об интенсивности синтеза NO судили по количеству продукта реакции (NaNO 2 ) взаимодействия NO с молекулярным кислородом. С этой целью к 0,4 мл исследуемой смеси добавляли 0,2 мл реактива Гриса. Раствор инкубировали в течение 15 мин. и колориметрировали при λ =540нм (Pahan K. et al., 2000).

Количество общих липидов определяли с помощью фосфованилинного реактива в присутствии концентрированной серной кислоты. Интенсивность красной окраски раствора, образованной вследствие реакции, измеряли колориметрически, при длине волны λ =530нм (Грибанов Г.А. и др., 1999).

Уровень содержания малонового диальдегида определяли колориметрически, при длине волны λ=532нм. Метод основан на реакции малонового диальдегида с тиобарбитуратом. При высокой температуре, в кислой среде, конечным продуктом реакции является окрашенный триметидиловый комплекс (Грибанов Г.А. и др., 1999).

Определение концентрации белка производилось по методу Лоури (Lowry O.H. et al., 1951).

Таблица 1. Динамика изменения содержания NO (мкмоль/мл) в разных тканях белых крыс во время стресса, вызванного изоляцией и нарушением циркадного цикла

	контроль	10-дневный стресс	20-дневный стресс	30-дневный стресс
Головной мозг
митохондрии	0,20± 0,01	0,15± 0,06	0,09±0,02	0,65±0,01
цитозоль	0,39±0,08	0,26±0,09	0,49±0,03	0,80±0,07
Кардиомиоциты
митохондрии	0, 16±0,2	0,14±0,06	0,21±0,03	0,82±0,07
цитозоль	0,35 ±0,02	0,33±0,06	0,39±0,04	0,98±0,09
Плазма крови	0,88 ±0,11	0,91±0,13	1,01±0,01	1,98±0,08

Таблица 2. Количественное распределения содержания общих липидов (мг/л) в разных органах белых крыс во время стресса, вызванной изоляцией и нарушением циркадного цикла

Ткани	контроль	10-дневный стресс	20-дневный стресс	30-дневный стресс
Головной мозг	2,64 ± 0, 10	2,69 ±0, 19	3, 00 ± 0,09	3,20 ± 0,14
Кардиомиоциты	2,04± 0,33	2,50 ± 0, 21	2,15 ± 0, 10	2, 20 ±0, 40
Плазма крови	3,42 ± 0, 32	3,40 ± 0, 14	4,08 ± 0,06	5,64 ± 0,17

Таблица 3. Количественное распределения малонового диальдегида (нм/л) в разных тканях белых крыс во время стресса, вызванного изоляцией и нарушением циркадного цикла

	контроль	10-дневный стресс	20-дневный стресс	30-дневный стресс
Головной мозг митохондрии цитозоль	0, 33±0,006 1,80 ±0,73	0,35±0,04 1,82±0,08	0,81±0,01 1,90±0,03	1,20±0,03 1,78±0,11
Кардиомиоциты митохондрии цитозоль	0,59±0,10 0,98 ±0,12	0,88±0,08 1,05±1,03	3,33±0,16 2,40±0,27	6,30±0,33 2,47±0,19
Плазма крови	6,6±1,45	5,01±0,09	2,98±0,06	2,08±0,24

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В первой серии опытов было изучено количественное изменение содержания оксида азота (NO) в плазме крови, головном мозгу и сердечной мышце белых крыс при изоляции животных и нарушении циркадного цикла.

Полученные результаты представлены в таблице 1.

Как следует из таблицы, в следствии 10дневного стресса, по сравнению с контролем, количество NO уменьшается в тканях головного мозга, тогда как в плазме крови этот показатель увеличивается. В кардиомиоцитах отмечается недостоверное уменьшение количества NO. 20дневный стресс характеризуется повышением концентрации NO в кардиомиоцитах и в плазме крови, то время, как в тканях головного мозга отмечается его количественное увеличение. Вследствие 30-дневного стресса, во всех тканях стрессированных животных, по сравнению с контролем, отмечается повышение содержания NO.

Учитывая литературные данные о количественном изменении содержания NO в условиях стресса и о его значении в перекисном окислении липидов (Fabisiak J P. et al., 2000; O’Donnel V.B., Freeman B.A., 2001), в дальнейшей серии опытов было изучено изменение количественного содержания общих липидов в разных тканях белых крыс вследствие изоляции и нарушения циркадного цикла.

Как видно из данных, приведенных в таблице 2, динамика изменение количественного содержания общих липидов в процессе стресса, неоднозначна. В частности, в плазме крови повышения содержания липидов наблюдается после 10-дневного стресса. В частности, на 20-ый день изоляции животных содержания липидов возрастает приблизительно на 20%, а на 30-ый день этот показатель возрастает до 60%. С найменьшей интенсивности повышение содержания липидов наблюдается также в головном мозге (20%), тогда как в кардиомиоцитах этот показатель практически не меняется.

Полученные данные дают основание предположить, что эмоциональный стресс, вызванный изоляцией и нарушением биоритма животных, влечет изменения метаболизма липидов, что вероятно обусловлено ответной реакцией организма на стресс.

Как известно, метаболизм липидов тесно связан с перекисным окислением липидов (Чеснокова Н.П. и др., 2006). Исходя из этого, в дальнейших опытах была изучена интенсивность перекисного окисления липидов, что является одним из возможных компонентов быстрой реакции на стресс.

Известно, что в нормальных условиях жизнедеятельности перекисное окисление липидов (ПОЛ) в клетке поддерживается на постоянном уровне с помощью антиоксидантной системы (Bounous G., Molson J.H., 2003). Продукты ПОЛ могут являтся как индукторами, так и первичными медиаторами особого состояния клетки при стрессе.

В таблице 3 представлены показатели количества малонового диальдегида (МДА), который, как известно, является одним из наиболее важных конечных продуктов перекисного окисления липидов.

Как видно из таблицы 3 изоляция животных и параллельное нарушение циркадного биоритма влияет на количественное содержание малонового диальдегида (МДА). В частности, при продолжении стресса, во всех исследуемых тканях белых крыс наблюдается достоверное увеличение содержания МДА, что в свою очередь свидетельствует об увеличении вероятности патологических состоянии организма.

Настоящий проект выполнен при финансовой поддержке Национального Научного Фонда Грузии (Грант № GNSF/ST08/2-375 ). Все идеи в статье принадлежат авторам и могут не совпадать с мнением Национального Научного Фонда Грузии.