Колоканцерогенез: онкоиммунология локальных изменений

В России колоректальный рак входит в первую десятку злокачественных опухолей, как по заболеваемости, так и по смертности. В общей структуре онкологических заболеваний шестое место занимает ободочная кишка (6,1%), седьмое – прямая кишка (5,2%) [3].

Механизмы возникновения и развития колоректального рака различны. Существуют экзогенные (пища, алкоголь, курение и др.) и эндогенные факторы (сахарный диабет, метаболический синдром, нарушение жирового обмена и др.), влияющие на развитие заболеваний желудочно-кишечного тракта [7, 16]. Кроме того, к факторам возникновения колоректального рака можно отнести и семейную предрасположенность, так называемые наследственные раки, гендерные различия, возрастные изменения, состояние микрофлоры кишечника [4, 3, 10].

Наличие аденом ободочной кишки является одним из самых существенных факторов риска развития рака. Аденоматозные полипы являются весьма распространенной патологией слизистой оболочки кишечника. Несмотря на то обстоятельство, что в экспериментальных условиях показана возможность развития рака толстой кишки на фоне неизмененной слизистой оболочки, подавляющее число как отечественных, так и зарубежных авторов полагают, что рак ободочной кишки в большинстве случаев развивается из аденом [1, 8, 35]. Большинство исследователей полагают, что полипы толстой кишки, особенно множественные, являются предраковым заболеванием, и большая часть карцином проходит стадию железистого полипа. Степень эпителиальной дис- плазии в аденоме обычно позитивно коррелирует с её размерами. Наиболее частыми типами полипов толстой кишки являются: аденоматозные полипы или аденомы; ювенильные полипы; гиперпластические полипы [1, 8].

Аденоматозные полипы представляют наибольшую опасность с точки зрения возможности малигнизации. По морфологическому строению различают три основные группы аденом: тубулярные, тубулярно-ворсинчатые и ворсинчатые аденомы (виллезные опухоли). Последняя разновидность аденом наиболее часто малигнизируется [1, 8].

Хроническое воспаление в той или иной степени выраженности может служить фоном для возникновения колоректального рака [21]. Воспалительные заболевания кишечника делятся на ряд патологических процессов с различной этиологией: язвенный колит, болезнь Крона (БК), недифференцированный колит (НК), занимающий промежуточное положение между язвенным колитом и болезнью Крона [2, 5, 9]. Воспалительные заболевания кишечника вызывают пролиферацию в слизистой оболочке толстой кишки, что ведет к возникновению опухоли. Толстая кишка является онкогенной зоной организма и носителем ряда предопухолевых процессов: микробиота, состав которой меняется, может быть источником воспаления слизистой оболочки; длительные воспалительные хронические заболевания с аутоиммунным деструктивным компонентом (язвенный колит, болезнь Крона); полипозный синдром. Отправной точкой реализации онкоизменений являются эпителиальные клетки слизистой оболочки кишки [12].

Иммунная система желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) представлена лимфоидной тканью, ассоциированной с кишечником (GALT-gut associated lymphоid tissue), располагается в трех частях – диффузно распределена по собственной пластинке под кишечным эпителием, в самом эпителии и в организованных лимфоидных фолликулах, таких как пейеровы бляшки. Она находится в самом тесном контакте с громадным потоком микробного и аллергенного материала, поступающего из просвета кишечника, и служит первым барьером на его пути [6, 24].

Ткани колоректального рака человека инфильтрированы различными иммунными/воспалительными клетками. Иммуногистохимические исследования показали, что большое значение имеет число Т-лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, что является прогностическим фактором более длительной выживаемости больных раком толстой кишки [30]. Обычно ткань опухоли толстой кишки инфильтрирована малым количеством Т-лимфоцитов. В-клетки чаще всего наблюдаются в лимфоидных фолликулах [31]. Интраэпителиальные лимфоциты или туморинфильтрирующие лимфоциты – это обычно CD8+ Т-клетки. Число туморин-фильтрирующих интраэпителиальных CD8+ Т-клеток достоверно коррелировало с более длительной выживаемостью [22]. И, напротив, значительное количество CD8+ Т-клеток в строме опухоли и вдоль инвазивного ее края не являлось важным прогностическим фактором выживаемости больных [26]. Полученные результаты позволили предположить, что значение имеет не только, какие иммунокомпетентные клетки присутствуют в опухоли, но и где они расположены. Лимфоцитарный инфильтрат при колоректальном раке почти всегда сопровождается нейтрофильными и макрофагальными клетками.

• A. C. Diederichsen et al. показали, что низкое соотношение туморинфильтрирующих лимфоцитов CD4+/CD8+, выявленное при цитометрическом анализе, является независимым прогностическим фактором более длительной выживаемости больных [17]. Хотя в их исследованиях точно

не доказывается локализация туморинфильтрирующих лимфоцитов TIL in situ, в нем четко показано, что соотношение CD4+/ CD8+ очень важно и что этот фактор взаимосвязан с ролью CD4+ CD25+ FОXP3+ регуляторных клеток в опухолевой ткани [19,22]. Проанализировав иммунные ответные реакции при колоректальном раке, F. Pages с соавт. провели всесторонний анализ TIL [27]. Они концентрировали свое внимание на ранней метастатической инвазии, которая включала следующие гистологические параметры – сосудистые эмболы (опухолевые клетки, лимфоцитарную инвазию, периневральную инвазию – все эти параметры авторы объединили в понятие VELIPI). На основании анализа 959 больных было показано, что VELIPI является независимым прогностическим фактором. Генетический анализ 75 больных показал, что уровни мРНК гранзима В и гранулизина в CD8+, выше в VELIPI отрицательных опухолях, чем в VELIPI положительных опухолях. Эти авторы выполнили цитометрический анализ 39 больных, с целью дифференцировки между наивными Т-клетками (CD3+CCR7+), Т-клетками памяти (CD45RО+CCR7-CD28+CD27+) и эффекторными клетками памяти (CD45RО+CCR7-CD28-CD27-) в опухолевой ткани. VELIPI отрицательные опухоли содержат высокое число зрелых CD8+ Т-клеток. Более того, было показано, что VELIPI отрицательные опухоли при иммуногистохимическом анализе у 377 больных содержат высокое число CD45RО+ клеток памяти. VELIPI отрицательные опухоли у больных без рецидивов имели достоверное повышение Тh1 медиатора Т-ВЕТ, интерферонрегуляторного фактора-1 и INF- γ по сравнению с VELIPI положительными опухолями у больных с рецидивом. И при регрессионном анализе СОХ было обнаружено, что число CD45+RО+ является независимым прогностическим фактором наряду с классификацией ТNM. Данное исследование подтверждает предположение о том, что иммунологические наблюдения имеют важное прогностическое значение при колоректальном раке [19, 22].

• J. Galоn et al. показали, что экспрессия рецепторов Тh1 адаптивного иммунитета обратно коррелирует с рецидивом опухоли [18]. Больные CD3cт^high, CD3iм^high + CD45RОcт^high CD45cм^high имели более длительную безрецидивную выживаемость, в то время как больные с CD3cт^lоw, CD3iм^lоw + CD45RОcт^lоw CD45im^lоw имели более низкую выживаемость, что позволяет предположить, что плотность рецепторов иммунных клеток является более значимым прогностическим фактором, чем стадия TNM [26].

Пользуясь высокочувствительным методом, T. Tachibana с соавт. удалось показать, что при колоректальном раке в опухоли уровень NK-T клеток с экспрессией маркера ранней активации CD69+ больше, чем в неизмененной слизистой оболочке кишки [33]. Инфильтрация NK-T положительно коррелировала с меньшим числом метастазов в лимфоузлы, а число NK-T клеток являлось независимым прогностическим фактором для более длительной выживаемости и безрецидивного периода, хотя в их работе не указывается на точную локализацию инфильтрации NK-T клеток в тканях рака ободочной кишки. T. Tsuruyama и F Pagёs et al. показали, что клетки располагаются вдоль инвазивного поля [34, 28].

Известно, что экспрессия МНС I на поверхности клетки является предпосылкой для распознавания Т клеток-мишеней. A. G. Menоn et al. показали, что сниженная экспрессия МНС I, особенно экспрессия HLA-A в опухолевых клетках, коррелировала с более длительной безрецидивной выживаемостью [23]. Авторы показали, что наличие CD8+ и CD57+ клеток является независимым прогностическим фактором более длительной выживаемости в безрецидивном периоде.

Инфильтрация опухоли CD8+ и CD57+ клетками обратно коррелировала с экспрессией HLA-B/C и HLA-A опухолевыми клетками, те же авторы подтвердили, что интраэпителиальных клеток CD56+ было меньше в опухоли, чем инраэ-пителиальных клеток CD8+, и что потеря МНС I в клетках злокачественной опухоли связана с более высоким числом интраэпителиальных клеток CD8+, но не NK клеток с CD56+ [29]. Однако интерпретация этих данных пока еще не совсем ясна. Таким образом, интраэпителиальные Т-клетки CD8+ могут присутствовать, несмотря на снижение экспрессии МНС I раковыми клетками ободочной кишки. И CD8+ и NK-клетки играют важную роль в противоопухолевом иммунитете при колоректальном раке [30].

Дендритные клетки (DK) – это наиболее активные антигенпрезентирующие клетки. Их основные функциональные зоны – это региональные лимфоузлы [11]. Однако DK распределены и в периферических воспалительных тканях. При колоректальных раках зрелые DK распределены вдоль инвазивного края опухоли вместе с Т-клетками [32]. DK имеют важное прогностическое значение. A. R. Dadabayev et al. показали, что DK, экспрессирующие МНС II, в основном распределены в строме опухоли, и их большое содержание в опухоли связанно с более коротким сроком выживаемости [14], однако возможно, что эти DK могут быть незрелыми, поскольку зрелые DK и Т-клетки обычно не находятся в строме опухоли [28], а чрезмерная экспрессия молекул адгезии (ICAM–I) фибробластами в строме может нарушать функции DK.

Было показано, что низкое содержание перитуморальных макрофагов (CD68+) и интраэпителиальных CD8+ Т-клеток обратно взаимосвязано со стадией опухолей [13]. Это может быть следствием подавления системной иммунной супрессии при запущенных стадиях; и наоборот, недостаточная инфильтрация этих клеток может быть причиной метастазов.

Функция макрофагов может быть как противоопухолевой (М1), так и проопухолевой (М2) [20]. Фенотипический переход от M1 до M2 может быть под действием цитокинов, секретируемых опухолевыми клетками и лимфоцитами, так IFN-у стимулирует фенотипическую поляризацию макрофагов в M1, а IL-4, IL-10 и IL-13 в М2 [20].

Таким образом, анализ данных литературы выявил разнонаправленные мнения о роли локального иммунитета в патогенезе рака толстой кишки. Недостаточно данных о роли локального иммунитета в микроокружении опухоли при раке и полипах толстой кишки, и хронических колитах.

ЦЕЛЬ

Изучить локальный иммунитет при раке толстой кишки, аденоматозных полипах и поверхностных хронических колитах и оценить роль иммунокомпетентных клеток и цитокинов в канцерогенезе толстой кишки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

На клиническом материале 200 больных с заболеваниями толстой кишки (113 больных раком толстой кишки, 47 больных аденоматозными полипами толстой кишки, 40 больных поверхностным хроническим колитом) изучены в сравнительном аспекте локальные иммунологические механизмы канцерогенеза толстой кишки. Материалом исследования служили ткань опухоли, а также участки кишки на расстоянии 1–3 см от опухоли – перитумораль-ная зона и 7–10 см от опухоли – линия резекции, взятые интраоперационно. У больных аденоматозными полипами исследовали биопсийный материал ткани полипа, а также слизистую оболочку кишки отступая на 1–3 см и 7–10 см от полипа. При эндоскопическом исследовании проводили забор биопсийного материала больных поверхностным хроническим колитом. Иммунофенотипирование тканевых лимфоцитов (СD3+, СD3+СD4+, СD3+СD8+, CD16+ CD56+, СD19+, Т-лимфоциты с рецепторами сф и уб) оценивали с использованием моноклональных антител методом проточной цитофлюориметрии. Уровень цитокинов (TNF-а, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-1RA) определяли иммуноферментным методом. Статистическая обработка результатов исследования проведена с использованием пакета современных компьютерных программ STATISTICA 7.0 (StatSoft Inc., США) и MedCalc (версия 9.3.5.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Оценка локального иммунного статуса при местно-распространенном раке толстой кишки показала, что содержание Т-хелперно-индукторных лимфоцитов (СD3+СD4+) в ткани опухоли было статистически достоверно выше на 45,0%. Соответственно в 1,8 раза и на 52,0% был выше индекс CD4+/CD8+ по сравнению с показателями условно здоровой ткани и пери-туморальной зоны (р<0,05), но снижено на 19% количество СD8+-клеток и В-лимфоцитов на 22,0% по сравнению с показателями условно здоровой ткани и на 43,0% относительно пери-туморальной зоны (р<0,05) (табл. 1). В перитуморальной зоне, напротив, было отмечено высокое содержание CD19+ клеток (на 36,0%), но также низкое количество цитотоксических клеток (CD8+) (на 19,0%) по сравнению с показателями по линии резекции (р<0,05) (табл. 1). По другим критериям достоверных отличий не обнаружено. Исследования локального иммунного статуса в различных отделах толстой кишки (ободочная (сигмовидная) и прямая) не выявили достоверных отличий.

В целом, местно-распространенный процесс характеризовался высоким содержанием туморинфильтрирующих Т-хел-перно-индукторных лимфоцитов (CD3+CD4+, CD3+CD4+/ CD3+CD8+) и низким эффекторных цитотоксических (CD3+CD8+ и CD19+) клеток. Однако, перитуморальная зона, возможно, сохраняла иммунный барьер за счет повышенного содержания туморассоциированных В (CD19+)-лимфоцитов по сравнению с интактной тканью.

Сравнительный анализ локальных иммунологических показателей у больных II и III стадией рака толстой кишки не выявил существенных различий, что подтверждает однонаправленность локальных иммунных механизмов при местно-распространенном раке.

Иные изменения были при раке толстой кишки с метастазами в печень. В ткани опухоли при местно-распространенном и метастатическом раке толстой кишки изменения были однонаправленные, т.е. процесс характеризовался высоким содержанием туморинфильтрирующих Т-хелперно-индукторных лимфоцитов (CD3+CD4+), но низким – цитотоксических (CD3+CD8+)

Таблица 1 . Иммунологические показатели в тканях кишки у больных местнораспространенным, метастатическим раком и полипами толстой кишки, %
Субпопуляция лимфоцитов	Местно-распространенный рак, n=73 перитумор. линия опухоль зона     резекции			Метастатический n=40 перитумор. опухоль зона		рак, линия резекции	полип	Аденома, n=47 1–3 см от полипа	7–10 см от полипа
CD3+	65,5±2,7	52,5±2,0	59,1±3,1	63,6±3,8 •	41,1±3,2	56,9±3,6	77,8±3,4	57,6±3,3 *	70,6±3,6
CD3+ CD4+	35,9±1,7 *	24,9±1,7	24,7±1,5	34,2±2,8 *	25,5±2,9	25,9±2,9	41,3±2,6*•	24,9±3,8	31,8±3,2
CD3+ CD8+	29,2±1,7 *	29,1±2,1 *	36,1±2,5	24,0±3,3	19,8±2,8 *	28,2±2,7	35,2±2,2	32,2±2,9	36,5±2,6
CD16+ CD56+	12,3±1,9	11,3±2,0	10,5±1,5	14,1±3,6 *•	9,3±2,9	7,7±2,4	9,0±2,3	21,5±2,3*	13,1±1,9
CD19+	18,6±2,0 *	32,4±2,9 *	23,7±2,4	26,2±2,4 *•	43,5±3,4 *	34,1±2,7	12,8±3,0	20,6±2,0	16,8±2,9
TСRсф	42,8±5,1	31,9±3,6	36,1±4,3	33,2±4,1	32,9±3,9	33,6±3,6	21,9±2,2	17,3±2,1	16,3±2,6
TCRyd	10,9±1,5	9,0±0,98	10,8±1,4	6,1±1,2	5,5±1,3*	9,1±1,3	20,4±2,1	17,9±1,9*	24,5±2,6
CD4+/ CD8+	1,7±0,2 *	1,12±0,2	0,94±0,1	1,4±0,1	1,4±0,2	1,4±0,3	1,9±0,5	0,9±0,2	1,1±0,4

Примечание – статистически достоверно относительно линии резекции (7–10 см – условно-здоровая ткань): * – по критерию Стьюдента, р<0,05; • – по Z-критерию, р<0,05

Рис. 1. Уровень субпопуляций лимфоцитов в условно-здоровых зонах

и В(CD19+) клеток. При метастазах отмечен значительно более высокий уровень туморинфильтрирующих натуральных киллеров. Перитуморальная зона характеризовалась сниженным количеством цитотоксических Т- (CD3+CD8+) клеток с рецепторами TCR ydи повышенным – В-клеток (табл. 1).

Оценка локального иммунного статуса аденомы показала однонаправленные изменения, как и при злокачественном процессе, но в отличие от рака в полипе было низкое содержание натуральных киллеров при повышенном уровне CD3+CD8+-лимфоцитов.

Микроокружение аденомы (1–3 см от полипа) характеризовалось, напротив, высоким уровнем NK-клеток (в 2 раза), но низким количеством Т(CD3+)-клеток и лимфоцитов с рецепторами TCR уб (на 18,0 и 27,0% соответственно) (р<0,05) (табл. 1).

Представлялось интересным изучить соотношение «условно-здоровых» тканей в исследуемых группах, т.е. выявить насколько опухолевый процесс затрагивает изменения непосредственно в иммунном микроокружении опухоли в сравнении с отдаленными участками кишки (рис.1).

Таблица 2 .

Уровень цитокинов в тканях кишки при полипах и раке толстой кишки

Цитокины	Аденома, n=47			Аденокарцинома, n=113
	полип	1–3 см	7–10 см	опухоль	перитумор. зона	линия резекции
IL-2	34,97±8,01	33,4±5,8 1	61,5±9,5	17,4±3,031	6,9±1,56	5,34±0,87
TNF-a	6,8±1,31	5,6±1,2	4,49±0,94	16,69±1,21	11,17±1,5	11,98±0,77
IL-6	20,4±8,6	24,5±6,9	39,24±9,4	197,9±25,921	72,2±17,32	54,41±10,6
IL-8	183,2±43,1	166,4±53,7	166,04±33,3	517,91±27,011	239,33±40,9 1	126,02±16,9
IL-10	21,6±3,3	13,4±2,8	17,0±2,8	7,56±2,14	5,92±1,49	8,02±2,72
IL1a	44,5±6,0	49,4±6,02	59,2±8,1	268,12±36,51	82,24±11,95	101,13±14,2
IL-1RA	3755,3±268,8	2335,3±39,1	2881,2±256,0	5652,2±258,41	3748,9±313,4	3774,2±394,8

Примечание – отличия статистически достоверны от показателей линии резекции (7–10 см от полипа или опухоли) по критерию Стьюдента, р<0,05

Найдено, что слизистая оболочка толстой кишки при поверхностном хроническом колите характеризовалась высоким уровнем натуральных киллеров, цитотоксических (CD3+CD8+) и Т-лимфоцитов с рецепторами yd, но угнетением В-клеточ-ного звена иммунитета. Обратная тенденция наблюдалась при раках. Полипы занимали промежуточное положение (рис. 1). Представляло особый интерес изучение тканевого цитокинового спектра. Цитокины, как известно, являются главными продуктами иммунокомпетентных клеток, которые, с одной стороны, влияют на функции этих клеток с усилением их противоопухолевой активности, а с другой – стимулируют рост опухоли.

Мы изучили уровень тканевых цитокинов (IL-2, TNF-a, IL-6, IL-8, IL-10, IL-1, IL-1RA) в опухоли и в окружающих тканях (табл. 2).

В основном все изученные цитокины в аденокарциноме имели высокий уровень, кроме IL-10. Так, содержание IL-2, IL-6, IL-8, IL-1a в ткани опухоли было выше в 2–4 раза, чем в перитуморальной зоне и в 3–5 раз по сравнению с зоной резекции. При этом в области линии резекции уровень IL-8 статистически достоверно был ниже в 2 раза по сравнению с перитуморальной зоной (табл. 2).

В полипе, а также вокруг него (1–3 см), снижено содержание IL-2 (на 43,0 и 44,0% соответственно, р<0,05), продуцентами которого являются Т-хелперно-индукторные лимфоциты. Несмотря на их высокое количество в аденоме, эти клетки, по всей вероятности, оказались функционально не состоятельны для реализации специфической иммунной защиты. Кроме того, в аденоме отмечен низкий уровень IL-6 (на 48,0%) и относительно высокий IL-1RA (р<0,05). Отмечено разнонаправленное содержание тканевого IL-10. Так, его уровень в доброкачественной опухоли был выше на 27,0%, а в 1–3 см от неё – ниже на 21,0%. Такая же тенденция наблюдалась и для IL-1RA – в опухоли его было выше на 30,0%, а в прилегающей зоне ниже на 19,0%. Таким образом, в ткани аденомы повышено содержание провоспали-тельных цитокинов (TNF-a, IL-8, IL-10, IL-1RA) (табл. 2).

Найденная прямая корреляционная зависимость между уровнем TNF-a в аденоме и в интактных тканях (r=0,72 по сравнению с 1–3 см, r=0,98 по сравнению 7–10 см, р<0,05) и между «условно здоровыми зонами» (r=0,57, р<0,05), демонстрирует, что продукция TNF- α в ткани аденомы может дистантно влиять на ее микроокружение.

Цитокиновый уровень в условно-здоровых тканях толстой кишки имел более низкие значения за исключением высокого содержания IL-2, IL-10 и IL-8 в слизистой оболочке при колите, продуцентами которых являются Т-лимфоциты, антигенпрезентирующие клетки, а также клетки эпителия кишечника.

ВЫВОДЫ

Таким образом, развитие злокачественного процесса при раке толстой кишки во многом определяется взаимовлиянием пула опухолевых и иммунокомпетентных клеток, продуктов их активности – цитокинов. Локальные иммунологические нарушения в пренеопластических тканях толстой кишки предопределяют патогенетическую инициацию рака толстой кишки. Микроокружение неоплазмы по иммунологическим параметрам является опухолевым полем, способствующим дальнейшему прогрессированию аденокарциномы толстой кишки, а при аденоматозных полипах определяет либо его злокачественную трансформацию, либо служит буферной зоной.