Комбинированное действие хронического ионизирующего излучения и многократного лазерного воздействия на когнитивные функции крыс

В медицине в терапевтических целях широко применяют низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ), однако возможные эффекты сочетанного действия лазера и других факторов изучены недостаточно. Большой научный и практический интерес представляет изучение возможных эффектов лазерного воздействия на центральную нервную систему людей, получивших в результате радиационных аварий или медицинских процедур разные дозы хронического ионизирующего облучения.

В научной литературе в основном говорится о положительном влиянии НИЛИ на различные функции организма, нарушенные под воздействием ионизирующей радиации [1-9]: усиление регенеративных возможностей организма, снижение уровня цитогенетических повреждений тканей, восстановление иммунной системы, улучшение метаболизма. Однако появились отдельные работы, указывающие на возможное негативное действие НИЛИ посредством вызова мутаций или эпигенетических нарушений [10-12], путём разнонаправленного действия на разные линии клеток в пределах одного организма [13], двухфазного ответа организма на НИЛИ [14].

Колганова О.И.* – ст. науч. сотр., к.б.н.; Изместьева О.С. – вед. науч. сотр., к.б.н.; Панфилова В.В. – науч. сотр., к.б.н.;

Жаворонков Л.П. – проф. НОО, д.м.н. МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России.

Будаговский А.В. [10] указывал в своей дискуссионной статье: «С каждым годом среда обитания человека становится всё более агрессивной. …Поэтому любые новые разработки должны подвергаться тщательному анализу для выявления возможного риска их внедрения. В полной мере это относится и к лазерным технологиям». В большом обзоре ряда авторов [15] также сделано заключение, что необходимы дальнейшие исследования для выявления возможного негативного влияния НИЛИ в сочетании с другими воздействующими факторами. Нами сделана попытка в модельных опытах на животных оценить последствия транскраниального облучения лазером животных, ранее подвергнутых хроническому ионизирующему воздействию.

Материалы и методы

Работа выполнена на половозрелых крысах-самках Вистар, массой 190-220 г, полученных из питомника «Столбовая» РАН. Животных содержали в условиях вивария при естественном освещении и максимальной стандартизации температурного и пищевого режимов со свободным доступом к пище и воде.

В данном опыте было 4 экспериментальные группы животных, сформированные с учётом итогов предварительных испытаний: 1 – контрольная группа; 2 – НИЛИ, локальное облучение мозга в течение 5 дней по 15 мин в день (длина волны – 890 нм, длительность импульса – 100 нс, частота посылок импульсов – 10000 Гц, выходная мощность – 1,7 мВт); 3 – ионизирующая радиация (ИР), дистанционное облучение всего тела в течение 30 дней (5,3±0,5 мГр/ч, суммарная доза 3,7 Гр); 4 – ИР + НИЛИ.

Одновременно в эксперименте находились по 8-9 животных в группе. Опыт повторяли с недельным интервалом, результаты объединяли и обрабатывали статистически.

Животных групп 3 и 4 сначала в течение месяца подвергали хроническому внешнему гамма-облучению на установке «Эксперимент» (Россия) с изотопом 137Сs. Дозиметрические исследования проводили дозиметром типа 27012 (Veb RFT Messellektronik “Otto Schon”, Германия). Доверительную границу погрешности величины дозы определяли непосредственно в каждой клетке, куда на время облучения помещали животных. В эксперименте использовали уровень мощности поглощённой дозы в прямом пучке 5,3±0,5 мГр/ч. При этом животные содержались в клетках по 5 особей, облучали их круглосуточно, за исключением получасового перерыва для уборки и кормления. Суммарная поглощённая доза за 30 суток составляла около 3,7 Гр. Остальные крысы (группы 1 и 2) содержались в том же помещении за экраном.

После окончания гамма-облучения облучённых и необлучённых крыс переносили в другое помещение. У группы 2 и половины гамма-облучённых крыс в течение 5 дней по 15 мин в день в индивидуальных контейнерах облучали область мозга лазером (частота посылок импульсов – 10000 Гц, выходная мощность – 1,7 мВт). Остальных крыс (группы 1 и 3) в это же время подвергали таким же манипуляциям, как и группы 2 и 4, но при выключенном НИЛИ. В качестве источника излучения использовали терапевтическое лазерное устройство «МИЛА» (Малоярославецкий приборный завод, Россия) на основе малогабаритного полупроводникового лазера ЛПИ-105 (НПО «Рефлектор», Саратов) с длиной волны 890 нм и длиной импульса около 100 нс. Измерение средней выходной мощности излучения проводили при помощи дозиметра ИКТ-1Н (Россия). Подробно методика облучения лазером описана в статье [16].

Оценку эффектов воздействующих факторов производили с использованием метода выработки и воспроизведения условного рефлекса активного избегания (УРАИ) в челночной камере

Шаттл-бокс [17]. Использовали сеанс обучения из 50 циклов сочетаний условного и безусловного раздражителей при следующей последовательности сигналов: свет+звук – 4 с; болевое электрическое раздражение – с 4 по 12 с; пауза между циклами – 20 с.

При анализе выработки и воспроизведения УРАИ использовали ряд показателей, отражающих конечную результативность обучения (интегративные критерии), либо характеризующих скорость обучения (динамические критерии).

К интегративным критериям относили: 1) число нанесённых током ударов до регистрации первой реакции избегания (РИ) – лаг-фаза обучения; 2) общее число РИ за сессию; 3) количество перебежек в другой отсек после удара током; 4) число отказов (отсутствие перебежек даже на электрокожное подкрепление); 5) наличие крыс, имеющих серии из пяти и более РИ подряд (критерий оценки состояния консолидации памятного следа); 6) среднее по группе значение латентного периода реакции избегания либо перебежки.

Показатели скорости обучения основаны на оценке параметров кривых линейной регрессии, отражающих нарастание частоты РИ в процессе обучения. По коэффициентам уравнений линейной регрессии можно количественно определить различия в исходном уровне обученности и скорости обучения. К динамическим критериям также относили: 1) динамику количества РИ в процентах к максимально возможному за интервал в десять попыток с шагом в две попытки индивидуально у каждой крысы и в целом по группе; 2) критерий 50% обученности (ОБ-50) с доверительным интервалом (число попыток до появления 50% РИ в среднем у каждой крысы в группе).

Приведённый выше анализ позволяет оценить влияние воздействующих факторов на выработку УРАИ сразу после облучения (через 30 мин после окончания пятого сеанса воздействия лазером), а также на степень консолидации навыка (через 1 сутки) и сохранения навыка в долговременной памяти (через 2 недели).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием ряда методов параметрической (критерий t-Стьюдента) и непараметрической статистики (медианный критерий, критерий U-Манна-Уитни). Значимость различий считалась достаточной при p≤0,05.

Поскольку исходная способность к обучению у различных крыс в популяции существенно отличается, за 10-12 суток до начала гамма-облучения всех крыс тестировали на способность к выработке УРАИ по 30 попыткам, затем формировали экспериментальные группы животных по правилам рандомизации для создания в группах равных стартовых возможностей [16].

Результаты и обсуждение

При первом тестировании (табл. 1, рис. 1) у крыс из группы 2 воздействие лазером не привело к существенному ухудшению обучаемости животных. Можно отметить только статистически значимое увеличение числа отказов. Животные группы 3 (гамма-облучение) ни по каким показателям не отличались от контроля. Иная картина вырисовывается при анализе результатов группы 4. У крыс, подвергнутых комбинированному воздействию, отмечается статистически значимое увеличение количества отказов, обучение они начинают с более низких стартовых позиций (коэффициент А у контрольной группы – 15,4±3,5, у группы 4 – 2,8±2,5*), снижена скорость обучения (коэффициент В у контрольной группы – 2,6±0,3, у группы 4 – 1,7±0,2*), и, как итог, значительно меньше общее число УРАИ за сессию и больше показатель ОБ-50. Кроме того, у крыс группы 4 нарушена кратковременная память – меньше крыс с сериями РИ.

Таблица 1

Интегральные и динамические показатели обучаемости крыс в челночной камере

№ теста	Групп ы	Лаг-фаза	Число УРАИ	Число отказов	Регрессия нарастания, % УРАИ		ОБ-50	Число крыс с сериями УРАИ ≥5
					коэф. А	коэф. В
1	1	6,4±2,8	22,4±3,3	1,2±0,4	15,4±3,5	2,6±0,3	57,7±10,7	12/18
	2	6,4±1,9	16,1±3,1	6,6±2,3*	5,4±3,4*	2,4±0,3	85,4±8,8	8/17
	3	4,8±1,9	20,7±2,6	2,9±1,3	11,9±2,9	2,7±0,2	62,6±4,4	9/18
	4	7,4±2,4	11,4±2,0*	5,9±1,8*	2,8±2,5*	1,7±0,2*	168,0±23,7*	5/17*
2	1	4,6±1,6	28,9±3,2	2,2±0,6	30,0±3,4	2,8±0,3	34,4±5,8	15/18
	2	8,7±2,5	27,6±3,6	2,9±1,2	32,1±3,7	2,3±0,3	38,7±3,7	12/17
	3	3,5±1,1	30,6±3,1	2,1±0,8	38,6±3,3	2,2±0,3	30,4±2,7	13/18
	4	8,3±2,2	20,8±3,2*	4,9±1,9	10,9±3,4*	2,8±0,3	61,4±5,2*	11/17
3	1	4,6±2,7	37,3±3,0	0,8±0,5	67,6±3,1	0,8±0,2	–20,4±4,4	16/18
	2	4,0±1,5	37,5±2,7	2,1±1,2	54,5±2,9	2,0±0,2*	10,6±1,0*	16/17
	3	5,4±2,9	34,4±3,5	3,1±2,1*	61,0±3,6	0,9±0,3	2,7±0,5	15/18
	4	3,5±1,1	32,1±3,4	3,3±1,6*	43,8±3,7	2,0±0,3*	24,6±2,9*	14/17

Примечание: * – значимые различия с контролем при Р≤0,05.

Порядковый номер шага

Рис. 1. Динамика нарастания количества РИ (% к максимально возможному РИ за 10 попыток с шагом в 2 попытки) в процессе обучения крыс сразу после окончания воздействия.

1 – контрольная группа; 2 – группа «НИЛИ»; 3 – группа «ИР»; 4 – группа «ИР + НИЛИ»;

* – значимое различие с контролем.

При повторном тестировании через сутки никаких различий между контрольными и подопытными животными группы 2 (НИЛИ) и группы 3 (гамма-облучение) выявлено не было (табл. 1). Однако различия между группами 1 и 4 остаются статистически значимыми и по интегральным, и по динамическим критериям (табл. 1, рис. 2), хотя и менее выраженными, чем при первом тестировании. Группа 4 начинает обучение с более низких стартовых позиций, чем контрольная группа за счёт значительного отставания при первом тестировании, у животных этой группы позднее, чем у контроля, появляются реакции избегания (статистически значимо выше показатель ОБ-50) и, соответственно, общее число УРАИ за сессию достоверно ниже, чем у контроля. Тем не менее, при повторном тестировании скорость обучения у группы 4 не отличается от скорости обучения у контрольной группы (коэффициент В в уравнении регрессии).

Для гигиенического нормирования наиболее важны отдалённые результаты воздействия. В табл. 1 и на рис. 3 приведены результаты третьего тестирования. Животные группы 2 через

1 тест

s 40

*

*

*

-•   4

*

две недели после облучения имеют худшую сохранность выработанного навыка (коэффициент А в уравнении регрессии), однако за счёт значительно более высокой скорости обучения к 20-й попытке догоняют контрольную группу по числу РИ за 10 попыток, а с 30-й достоверно опережают контрольную группу. Так, в период с 31-й по 40-ю попытку среднее число РИ в группе 1 составляет 7,6±0,6, в группе 2 – 9,1±0,4* РИ; в итоге, по общему числу УРАИ за сессию группы 1 и 2 не отличаются друг от друга. Группа 3 не отличается статистически значимо от контроля по способности к выработке УРАИ. Крысы группы 4 начинают обучение с более низких стартовых позиций, чем контрольная группа, однако за счёт более высокой скорости обучения к концу сеанса по интегральным показателям статистически не отличаются от контрольных животных (рис. 3).

s

0     5     10    15    20    25

Порядковый номер шага

Рис. 2. Динамика нарастания количества РИ (% к максимально возможному РИ за 10 попыток с шагом в 2 попытки) в процессе обучения крыс через сутки после окончания воздействия.

1 – контрольная группа; 2 – группа «НИЛИ»; 3 – группа «ИР»; 4 – группа «ИР + НИЛИ»;

* – значимое различие с контролем.

3 тест

0     5     10    15    20    25

Порядковый номер шага

Рис. 3. Динамика нарастания количества РИ (% к максимально возможному РИ за 10 попыток с шагом в 2 попытки) в процессе обучения крыс через сутки после окончания воздействия.

1 – контрольная группа; 2 – группа «НИЛИ»; 3 – группа «ИР»; 4 – группа «ИР + НИЛИ»;

* – значимое различие с контролем.

Таким образом, наиболее выражен негативный эффект комбинированного воздействия гамма-излучения и НИЛИ в ближайший период после окончания воздействия (1 и 2 тестирование). Постепенно этот эффект ослабевает и в течение двух недель нивелируется. Выявленное замедление обучаемости в первые сроки после сочетанного воздействия факторов, по-видимо-му, имеет транзиторный характер, поскольку через две недели интегральные, а также динамические показатели обучения у всех групп крыс достаточно близки.

Ранее нами были проведены исследования комбинации гамма-излучения и последующего транскраниального НИЛИ на самцах крыс Вистар при таких же параметрах воздействующих факторов [18]. Были получены аналогичные результаты: изолированное воздействие факторов не приводило к ухудшению обучаемости животных, тогда как при сочетанном действии факторов подопытная группа значимо отличалась от контрольной в худшую сторону. Единственное отличие от самок – у самцов негативный эффект был наиболее выражен при втором тестировании через сутки после воздействия.

Вероятно, при изолированном воздействии факторов образуются субповреждения, которые не выявляются нашей методикой, а при комбинированном действии эти субповреждения суммируются, вызывая нарушения условно-рефлекторной деятельности.

Обобщая результаты экспериментов, в которых в качестве воздействующего фактора использовали раздельное либо комбинированное применение пятикратного НИЛИ с длиной волны 890 нм и хроническое ионизирующее излучение в суммарной дозе 3,7 Гр, можно заключить, что:

• 1)    гамма-облучение с низкой мощностью дозы существенно не модифицировало условнорефлекторную деятельность взрослых крыс;

• 2)    транскраниальное воздействие лазером в данном режиме также не влияло значительно на выработку УРАИ у крыс;

• 3)    сочетанное действие этих факторов приводило к транзиторному негативному эффекту на выработку и воспроизведение УРАИ и, соответственно, может нести в себе потенциальную опасность для когнитивных функций мозга.

Но, вполне вероятно, при локальном воздействии на зону опухоли при сочетанном действии гамма- и лазерного излучения взаимное усиление их эффектов может быть полезно при лечении онкологических больных, позволяя снизить нагрузку на организм ионизирующего излучения при сохранении терапевтического эффекта. Но подобное предположение требует дальнейших исследований.