Компенсация различия электрофоретической подвижности флуоресцентно-меченых фрагментов ДНК при генетических анализах

Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование ДНК) в генетическом анализаторе выполняется путем разделения фрагментов ДНК в капилляре под действием электрического поля. Четыре последовательности пиков, соответствующие нуклеотидам A, C, G и T, регистрируются на выходе одноименных цветовых каналов флуоресцентного детектора. На экспериментальных "сырых" графиках наблюдается неравномерное распределение соседних пиков. Причина этого явления — различие электрофоретической подвижности флуоресцентно-меченых фрагментов ДНК [1–5.] Для определения нуклеотидной последовательности эти графики объединяются с использованием общего временнόго масштаба. При частичном перекрывании соседних пиков и значительных случайных ошибках вычисления времен-нόго положения пиков возможны ошибки при определении истинной нуклеотидной последовательности.

В статье [6] приведен способ вычисления аппроксимирующей функции, представляющей монотонную аналитическую зависимость базового временнόго интервала Т _б от номера пика в виде полинома 3-го порядка. С помощью базовой последовательности пиков с интервалом Т б можно оценить неравномерность распределения соседних пиков.

В настоящей статье с целью значительного уменьшения погрешности определения временнό-го положения пиков предложен способ компенсации различия электрофоретической подвижности флуоресцентно-меченых фрагментов ДНК.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫЧИСЛЕНИЙ

Для компенсации различия электрофоретической подвижности флуоресцентно-меченых фрагментов ДНК предлагается следующая последовательность вычислений в среде Excel:

• 1)    получение экспериментальных данных разделения фрагментов секвенсной смеси и определение времен выхода пиков;

• 2)    оценка неравномерности последовательности пиков путем построения аппроксимирующей функции, представляющей зависимость базового временнόго интервала Т б от времени (номера пика) и позволяющей выразить неравномерность интервалов между пиками в базовых относительных единицах (б.о.е.);

• 3)    введение и оптимизация параметров временнόго сдвига пиков для каждого цветового канала;

• 4)    получение обработанных данных и построение уточненных графиков;

• 5)    оценка результатов компенсации различия электрофоретической подвижности флуоресцентно-меченых фрагментов ДНК.

  
  
  
  
  
  

Рис. 1. Вид участка пиков, отражающих результаты разделения фрагментов сек-венсной смеси.

а — экспериментальные данные; б — результаты компенсации различия электрофоретической подвижности

По горизонтали — приращение времени в секундах, по вертикали — значение интенсивности флуоресценции в относительных единицах (о.е.) в четырех цветовых каналах: пики 1, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 17, 18 — канал 1; пики 2, 9, 11, 13, 19 — канал 2; пики 6, 7 — канал 3; пики 14, 15, 16 — канал 4

РАЗДЕЛЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ СЕКВЕНСНОЙ СМЕСИ

В качестве примера использованы экспериментальные данные разделения фрагментов секвенс-ной смеси плазмидной ДНК, приведенные в статье [6]. При определении времен выхода пиков в четырех цветовых каналах флуоресцентного детектора использован программный модуль анализатора ДНК АЛ [7–9].

На рис. 1, а, показан небольшой участок экспериментальных данных, отражающих результаты разделения 19 фрагментов секвенсной смеси.

На графиках рис. 1, а, видно, что некоторые со- седние пики (1 и 2, 8 и 9, 10 и 11, 12 и 13, 18 и 19), соответствующие фрагментам ДНК, окрашенным разными красителями, в значительной степени взаимно перекрываются.

ОЦЕНКА НЕРАВНОМЕРНОСТИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПИКОВ

В табл. 1 приведены результаты вычисления аппроксимирующей функции, приведенные ранее в более полном составе в статье [6]. В таблице воспроизведен образ электронной таблицы Exсel, использованной для вычислений.

Табл. 1. Вычисление отличий временных интервалов между соседними пиками от базового временнόго интервала

A	B	C	E	F	M	J
1906	1	G	1900.80	5.85	0.62	0.28
1915.5	2	C	1906.65	5.85	0.20
1922.5	3	T	1912.50	5.86	–0.23
1927	4	C	1918.36	5.86	–0.66
1929	5	G	1924.21	5.86	0.11
1935.5	6	G	1930.07	5.86	0.88
1946.5	7	T	1935.93	5.86	–0.06
1952	8	A	1941.79	5.86	–0.40

В столбце А табл. 1 приведены положения центров пиков (время выхода в секундах), в столбцах В и С присвоены номера пиков и буквенные обозначения A, C, G и T, соответствующие каждому конечному нуклеотиду фрагмента и присоединенному к нему красителю.

В столбце F вычислены базовые временные интервалы Т б между соседними пиками (в секундах) на основе аппроксимирующей функции в столбце Е.

В столбце M приведены величины DN — отличия временных интервалов между соседними пиками от базового временнόго интервала в базовых относительных единицах (б.о.е.). Величины DN могут служить мерой неравномерности последовательности пиков, их можно рассматривать как сумму систематической и случайной составляю- щих погрешности измерения взаимного положения пиков.

В ячейке J вычислено стандартное отклонение (значение, приблизительно равное СКО). Использовался оператор

J=СТАНДОТКЛОН(M51:M350) = 0.28 (б.о.е.).

Результаты вычислений величин D N (столбец M) на участке 300 нуклеотидов в графическом виде представлены на рис. 2, а. На основе анализа результатов вычислений величин D _N можно предположить, что систематическая составляющая погрешности преобладает и ее можно компенсировать введением в дальнейший расчет соответствующих параметров.

Рис 2. Отличия временных интервалов между соседними пиками от базовых временных интервалов ( D _N).

а — экспериментальные данные; б — компенсированные результаты. Вертикальная ось — величины D N (б.о.е.). Горизонтальная ось — номера пиков. Для наглядности точки графика соединены прямыми линиями

ЗАДАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ КОМПЕНСИРУЮЩИХ ПАРАМЕТРОВ ДЛЯ КАЖДОГО ЦВЕТОВОГО КАНАЛА

В качестве компенсирующих параметров (поправок) предлагается использовать индивидуальный временной сдвиг пиков в каждом световом канале.

Результаты дальнейших вычислений приведены в табл. 2. Столбцы А , В и С табл. 2 заимствованы из табл. 1, столбец F табл. 1, который также будет использоваться, в табл. 2 не показан.

Поправки для каждого цветового канала в табл. 2 задаются в столбце L : L1 — для красителя А; L2 — для красителя C; L3 — для красителя G; L4 — для красителя Т. В начале расчета эти поправки принимаются, равными нулю.

В столбцах M , N , O и P поправки прибавляются к временам выхода пиков в столбце А соответствующих цветовых каналов А, С, G и Т. В столбце Q получается компенсированная последовательность пиков: Q = M + N + O + P .

В столбце R вычислены компенсированные временные интервалы между соседними пиками (в секундах): R n = Q n +1 – Q n .

В столбце S вычислены погрешности — отличия компенсированных временных интервалов между соседними пиками R от базовых временных интервалов F из табл. 1 (в секундах):

S = R – F.

В ячейке T1 — сумма квадратов погрешностей

Т1 = CyMM(S51 ^Л 2:S350 ^Л 2).

Величины в столбце L уточняются с помощью метода наименьших квадратов (минимум величины Т1 ) и метода последовательного приближения в меню " Данные\Анализ\Поиск решения" , изменяя величины поправок для каждого цветового канала в столбце L .

В столбце U вычислены величины относительных погрешностей взаимного положения компенсированных соседних пиков D _N. Значение ячейки U1 вычислено по формуле:

U1= S1/F1, где F1 — базовый временной интервал в первой строке табл. 1.

В ячейке T2 вычислено стандартное отклонение:

T2=СТАНДОТКЛОН(U51:U350) = 0.08 (б.о.е.).

Результаты компенсации различия электрофоретической подвижности (величины D N в столбце U) приведены на рис. 2, б.

ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ КОМПЕНСАЦИИ РАЗЛИЧИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ПОДВИЖНОСТИ ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК

В результате компенсации различия электрофоретической подвижности стали визуально значительно более равномерными расстояния между пиками на рис. 1, б, по сравнению с экспериментальными данными, приведенными на рис. 1, а.

Табл. 2. Вычисление погрешности взаимного положения соседних пиков при компенсации влияния различия электрофоретической подвижности флуоресцентно-меченых фрагментов ДНК

A	B	C	L	M	N	O	P	Q	R	S	T	U
1906	1	G	–0.79	0	0.00	1907.88	0.00	1907.88	7.16	1.31	61.8	0.22
1915.5	2	C	–0.46	0	1915.04	0.00	0.00	1915.04	6.81	0.95	0.08	0.16
1922.5	3	T	1.88	0	0.00	0.00	1921.84	1921.84	4.69	–1.16	–	–0.20
1927	4	C	–0.66	0	1926.54	0.00	0.00	1926.54	4.34	–1.52	–	–0.26
1929	5	G	—	0	0.00	1930.88	0.00	1930.88	6.50	0.64	—	0.11
1935.5	6	G	–	0.00	0.00	1937.38	0.00	1937.38	8.47	2.61	–	0.45
1946.5	7	T	—	0.00	0.00	0.00	1945.84	1945.84	5.36	–0.50	—	–0.08
1952	8	A	–	1951.21	0.00	0.00	0.00	1951.21	3.83	–2.03	–	–0.35

Можно сравнить величины D N в столбце М табл. 1 и в столбце U табл. 2, а также соответствующие этим величинам графики на рис. 2, а, и рис. 2, б. По результатам сравнения можно сделать следующий вывод: после компенсации различия электрофоретической подвижности флуоресцентно-меченых фрагментов ДНК значительно уменьшаются максимальные погрешности и стандартное отклонение (примерно в 3–3.5 раза).

После компенсации погрешности измерения взаимного положения пиков D N , приведенные на рис. 2, б, имеют случайный характер.

Уточненные графики на рис. 2 построены в диапазоне до 300 нуклеотидов. В этом диапазоне величина базового временнόго интервала Т б изменяется незначительно. С целью расширения диапазона применимости предложенного способа можно использовать калибровку и линеаризацию горизонтальной оси с помощью известного размерного стандарта 1200 LIZ [10].

В случае, если относительные погрешности взаимного положения компенсированных соседних пиков превосходят по абсолютной величине значение 0.3 б.о.е., можно утверждать, что это признак пропущенного или "лишнего" пиков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

• 1.    Предложен способ компенсации различия электрофоретической подвижности флуоресцентно-меченых фрагментов ДНК при определении нуклеотидной последовательности.

• 2.    На конкретном примере выполнена оптимизация параметров временнόго сдвига пиков для каждого цветового канала и построены уточненные графики в диапазоне до 300 нуклеотидов. В этом диапазоне величина базового временнόго интервала Т _б изменяется незначительно. С целью расширения диапазона применимости предложенного способа можно использовать калибровку и линеаризацию горизонтальной оси.

• 3.    Предложенный способ обеспечивает надежное определение пропущенных и "лишних" пиков. Для этого используются в качестве критерия отличия компенсированных временных интервалов между соседними пиками от базовых временных интервалов.

• 4.    Оценены результаты компенсации различия электрофоретической подвижности флуоресцентно-меченых фрагментов ДНК: погрешности определения временнόго положения пиков значительно уменьшаются и имеют случайный характер.